[求救] Far-western blot

看板Biotech作者 (人生就像個不可逆反應)時間12年前 (2012/05/21 13:24), 編輯推噓7(7推 0噓 14→)
留言21則, 8人參與, 最新討論串1/1
請問各位版友們有沒有做過far-western blot， 目前想用這實驗看protein protein interaction。 老闆說的protocol感覺怪怪的，我列出來讓大家看一下。 1、將sample load到wells跑SDS-PAGE。 2、Transfer到nitrocellulose membrane。 3、利用欲看interaction的純化蛋白(prey)，加入TTBS，使最終濃度(1ug/mL)。 4、用可偵測prey的一抗去認，再用相對應的二抗去認。 我看到網路上有一些protocol是在第二步和第三步中間，有一個blocking的步驟。 想問一下比較正確的方法是什麼呢？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.95.199
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05/21 14:43, , 1F
就跟一般western一樣 想要background乾淨一點就blocking啊
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05/21 15:04, , 2F
我在想在membrane的protein都已經denature了，所以用prey
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再去跟bait反應時，會跟在細胞裡一樣有反應嗎？
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我是怕denature後的protein已經看不到interaction了@@
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推
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那為什麼不做IP? 應該有個理由吧...
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推
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不做ip應該是想省抗體錢還有相關器材？另外原po考量
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是對的 你可以去問你老闆呀￣▽￣||
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推
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抱歉~學藝不精~沒學過far-western blot,查了一下發現是
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用non-Ab protein當probe~所以~strepavdin-biotin這種就
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可以算是far-western blot的應用嘛?!感謝指教
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我以為是問blocking 抱歉XD 如果是denature問題 應該要跑
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native gel?
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其實我做過IP，只是要說明protein-protein interaction
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需要更多的DATA去證實XD
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推
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GST pull down
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推
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推GST pull down...反過來用His也OK
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推
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Far-western不是很好做的樣子.. IP和GST算是目前主流
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推
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transfer後用guanidine-HCl denature後,TTBS renature,
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milk blocking, 加入prey protein, 之後再加入可以認
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prey protein的Ab~我真心懷疑原po跟我當初同間lab.....
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樓上是嗎XD
05/23 21:50, 21F
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