[討論] 使用PCR 產物去進行PCR 產生smear?

看板Biotech作者 (Goodday)時間13年前 (2012/04/13 17:11), 編輯推噓4(4推 0噓 7→)
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為了在cDNA clone 某約 160bp 的片段 已經得到PCR 產物，single band 原想說將PCR 產物稀釋再PCR 比較好P 但是稀釋不管 1/100000, 1/10000, 1/1000, 1/100 P 的結果都是嚴重的smear，約在數百至數千bp 位置產生smear 甚至做了gradient 溫度梯度仍然都是smear 的結果 看不見single band 但同條件用cDNA P 又得重新得到預期的single band 雖然我們後來決定乾脆還是由原本的cDNA 重頭來放大 但仍很好奇smear 怎產生的? 有人有同樣的經驗嗎? 感謝分享~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.60.122.200
推
04/14 10:52, , 1F
你不覺的用PCR產物在進行PCR 非常不適當嗎
04/14 10:52, 1F
推
04/14 16:01, , 2F
我有這種經驗!我想是原本的PCR產物雖然經過純化，但裡面
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04/14 16:03, , 3F
其實還有微量的non-specific band，因為長度比較短，
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再次PCR時就比major band更容易被amplify，目前尚無解法XD
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回一樓:有時從cDNA P出來真的很微量，但因實驗需求需要
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04/14 16:07, , 6F
較濃的產物，就會想試試這個方法。
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推
04/14 18:13, , 7F
真的要用產物P 我會建議切膠elute後再P會比較好
04/14 18:13, 7F
推
04/17 00:07, , 8F
smear是因為第一輪的PCR產物中其實有許多Polymerase沒跑完
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04/17 00:09, , 9F
所形成長短不一的片段，但在第一輪中的量不足在膠體中看見。
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然而在第二輪PCR時，這些訊號同時被放大，所以就產生了smear
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另外也推J大切膠出來當template.
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