[求救] iNOS跑出來的band

看板Biotech作者 (十月的兔子)時間12年前 (2012/04/09 17:36), 編輯推噓5(5推 0噓 14→)
留言19則, 5人參與, 最新討論串1/1
大家好我已經有用關鍵字查過相關的問題了 但是還是有遇到不解的地方 最近在壓iNOS和COX-2這兩種抗體 (cell signaling) iNOS 圖 http://i.imgur.com/3VBDW.jpg
COX-2 圖 http://i.imgur.com/MDXbI.png
一抗 (1:2000) 二抗 (1:1000) iNOS跑出來很淡，而且有一點一點雜訊的感覺 COX-2是有跑出來，但是跑出來的範圍就不平均，像一坨一坨的感覺 我好奇的是iNOS的為什麼會那麼淡，是抗體稀釋太過頭了嗎? 那COX-2為什麼又跑出來不好看，看paper上大家壓得都很有beta-actin的感覺... 會是收細胞(巨噬細胞)的問題嗎? 請有經驗的人幫忙看看並幫忙解惑~~~謝謝> < -- 每個人都把希望寄託在未來， 卻忘了未來是由每個現在所組成。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.143.163
推
04/09 19:20, , 1F
blocking多久?
04/09 19:20, 1F
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04/09 23:38, , 2F
大約都1個小時~頂多不會超過兩個小時
04/09 23:38, 2F
推
04/10 12:18, , 3F
蛋白是不是沒抽好~什麼細胞?處理多久?
04/10 12:18, 3F
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04/10 13:06, , 4F
RAW264.7巨噬細胞。是說抽細胞的時後，lysis buffer加進去收
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04/10 13:08, , 5F
時蛋白液會呈現黏稠狀，所以用離心抽取方式取上清液。
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04/10 13:09, , 6F
不然實驗室收蛋白液是不會用到離心機的..
04/10 13:09, 6F
推
04/10 23:51, , 7F
blocking久一點 4度c可以overnight..另外二抗太濃了
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04/10 23:51, , 8F
cell signaling的rabbit、mouse我都1:5000
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04/10 23:52, , 9F
另外你蛋白質量loading多少? transfer條件?
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04/11 10:07, , 10F
每孔load 入10ul~約20ug。跑膠時上膠60V 20分鐘，下膠120V
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04/11 10:08, , 11F
約80分鐘，轉漬是0.4V 60分鐘左右~ 大概是這樣Q Q
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04/11 10:08, , 12F
不知為什麼iNOS跑出來都這樣 ...
04/11 10:08, 12F
推
04/11 15:35, , 13F
我們也有跑 iNOS..應該不是你蛋白收得不好，頂多是保存
04/11 15:35, 13F
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04/11 15:37, , 14F
不好..細胞lysis之後黏稠物是DNA，離心把上清移到新的
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eppendorf，然後再去跑，你應該是抽到雜質了
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謝謝你們～~iNOS我blocking久一點~~背景雜質不見很多哩
04/16 17:26, 16F
推
04/16 20:48, , 17F
破細胞的lysis buffer配方可能有問題
04/16 20:48, 17F
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04/17 15:58, , 18F
我也覺得有這可能耶!!!!@ @但我們家lysis buffer是用買的
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04/17 15:58, , 19F
但收不同細胞跑其他的抗體卻沒有這種問題Q ~ Q
04/17 15:58, 19F
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