[求救] PCR一直有band

看板Biotech作者 (Chingching)時間12年前 (2012/03/03 17:53), 編輯推噓4(4推 0噓 18→)
留言22則, 11人參與, 最新討論串1/1
大家好 實驗希望以real-time pcr方式 量化轉染效率 於是設計一段primer可以夾出質體上的片段 primer所夾的位置位於質體上的 lac operon sequence到ori的區域 預期所夾出來的片段為140 bp 此primer已做過blast不會抓到任何human genomic DNA 但是不知為什麼 就算沒有transfect的細胞或是只用ddH2O當negative ctrl 都還是有訊號被偵測到 例如有轉染的細胞Ct值大概是12-13 但沒轉染的細胞或ddH2O,Ct值也有22-23 做了不同次, 不同sample也是一樣 使用的reagent已全部換新也是一樣的結果 請問板上的高手什麼會這樣呢? 好困擾呀, 拜託各位了! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.94.60
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03/03 17:59, , 1F
既然有band就拿去定序看看?
03/03 17:59, 1F
推
03/03 18:08, , 2F
有跑過膠?大小也是140bp?
03/03 18:08, 2F
推
03/03 19:07, , 3F
primer dimer? 有看過melting curve嗎?
03/03 19:07, 3F
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03/03 19:47, , 4F
跑膠的大小也是140 bp, melting curve也是完全重疊
03/03 19:47, 4F
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03/03 19:48, , 5F
一樣的位置
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03/03 19:49, , 6F
全部的sample都只出現一條band且都在相同位置
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03/03 19:50, , 7F
為了排除抽DNA污染,也有跟同學借DNA來跑, 也是有band!
03/03 19:50, 7F
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03/03 19:52, , 8F
感謝1,2,3樓的回覆, 到底為什麼會這樣啊?
03/03 19:52, 8F
推
03/03 20:44, , 9F
連只有水的也有140 bp那條band嗎??
03/03 20:44, 9F
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03/03 22:58, , 10F
重新設計 1.換位置 2.加長primer 3.提高primer等級
03/03 22:58, 10F
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03/03 22:59, , 11F
也可能是整套實驗器材汙染
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03/03 23:38, , 12F
primer 被汙染了?
03/03 23:38, 12F
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03/04 00:10, , 13F
也是正確size大概是污染吧
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03/04 13:09, , 14F
全部的東西都有重配, primer是拿stock再稀釋
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03/04 13:10, , 15F
所以是stock污染嗎?
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03/04 13:11, , 16F
沒錯,只有水的也只有140的band!
03/04 13:11, 16F
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03/04 14:08, , 17F
pipetman汙染?
03/04 14:08, 17F
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03/04 14:57, , 18F
所以要買新的primer 來測試嗎 @@!!
03/04 14:57, 18F
推
03/04 16:39, , 19F
汙染了 所有的東西換新的 連pipetman都要清
03/04 16:39, 19F
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03/05 22:09, , 20F
謝謝大家的意見, 我已經訂了新的primer, 並且重新設計
03/05 22:09, 20F
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03/07 15:03, , 21F
pipetman汙染啦
03/07 15:03, 21F
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03/07 15:05, , 22F
你改用filter tip試試看就知道了。
03/07 15:05, 22F
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