[求救] 質體轉不進表現菌株~請問有什麼辦法解決

看板Biotech作者 (紫)時間12年前 (2012/02/29 15:28), 編輯推噓10(10推 0噓 36→)
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小弟我在幾個星期前有發一篇相關的文 許多版友都認為可能是我insert DNA對細菌有致死性 所以我對實驗做了兩個部分的修改 應該可以證明 並不是上述原因 第一 我用的expression host 改成用BL21(DE3)pLysS 在有IPTG誘導的情況下 insert DNA才會表現 但是 轉型後還是不長菌 第二 我將做完電穿孔的菌液 分成兩半 塗在含有不同抗生素的盤子中 BL21(DE3)pLysS自己帶有抗chloramphenicol的基因 所以長在chloramphenicol的盤子上 非常良好 但 對應plasmid的抗抗生素基因的盤子 則是一個也長不出來 表示 我的plasmid根本沒有轉進去 我用的質體是pET20b 大小是3.7K左右 加上insert DNA之後 大小約為5.5K 將pET20b轉入BL21(DE3)pLysS 只要用3ng就長很多 (此為control 代表我的competent cell是可以用的 雖然效率差了點) 但是加上insert DNA的pET20b怎麼樣都長不出來 (應該說 轉不進去 請問大家有類似的經驗嗎? 該怎麼解決呢? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.122.198.84
推
02/29 16:39, , 1F
你有確認過vector的sequence沒有錯誤嗎？ 會不會是接上
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02/29 16:40, , 2F
insert的vector序列有錯，以致無法抗chloroamphenical
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02/29 17:31, , 3F
樓上誤解，原po應該是說無法抗plasmid上的Amp
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02/29 17:35, , 4F
blence沒錯
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推
02/29 19:46, , 5F
那會不會是insert沒帶stop codon做出奇怪的東西阿？
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02/29 19:47, , 6F
做不出你的目標蛋白和amp之類的
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02/29 22:40, , 7F
ampR是獨立的gene阿
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推
02/29 22:51, , 8F
理論上DH5alpha也是可以表現出蛋白質...
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推
03/01 13:40, , 9F
電不進去就是是傳統的heat shock吧 如果heat shock
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可以進去那就回頭檢討電的過程是那邊造成差異
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03/01 16:15, , 11F
stop codon是在plasmid上 也沒有被限制酵素切掉
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所以應該不是這個問題
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03/01 16:17, , 13F
我在想是不是因為質體大小的差異影響到轉型效率
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03/01 17:12, , 14F
電穿孔後，加LB medium 37degree 1hr試試看
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推
03/02 11:09, , 15F
我覺得你的二個修改並不能證明insert DNA對細菌沒有致死性
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03/02 11:11, , 16F
如果同時transform到BL21跟DH5alpha(or XL-blue?)
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就可以確認是不是表現的蛋白有毒性了
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推
03/02 20:49, , 18F
DH5a轉的進去嗎? ligation後直接轉BL21效果通常很差
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03/02 20:49, , 19F
先轉進DH5a再抽plasmid 再轉BL21試試看吧
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推
03/02 23:10, , 20F
試試樓上說的 而且你也不確定是不是ligation出問題
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03/02 23:47, , 21F
真是鬼打牆,原po文提過是將XL-blue長好的plasmid送到BL21卻
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03/02 23:49, , 22F
長不起來,如何懷疑這樣re-transform會跟ligation有關
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推
03/04 00:07, , 23F
掐指一算 原PO是第八個月了嗎 QQ
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03/04 00:08, , 24F
electroporation後先用LB在37C長 30~60min
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03/04 00:11, , 25F
然後離心除去大部分上清液後plate全部的細胞
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或許有機會提高效率
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03/04 00:14, , 27F
我會想拿些plasmid跑電泳,看size跟量
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03/05 12:48, , 28F
樓上大大...時間我已經不記得了TAT...
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03/05 12:49, , 29F
電完之後 放在37度LB培養一小時 這個動作我有做
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03/05 12:51, , 30F
但是離心取pellet倒是沒試過 但我是有把所有的菌液都塗
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03/05 12:53, , 31F
盤
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03/05 12:54, , 32F
plasmid 的大小跟insert DNA的大小都跑過電泳確認了
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03/05 12:55, , 33F
從XL1-blue抽出來plasmid的量也用nano drop測過
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03/05 12:59, , 34F
抽出來的plasmid濃度最高到122ng/uL 應該是沒問題的
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03/05 13:02, , 35F
這幾天又做了別的實驗 如同micocat所說
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03/05 13:04, , 36F
將plasmid轉到XL1-blue和BL21(DE3)pLysS中
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03/05 13:04, , 37F
轉到XL1-blue長了很多 但轉到BL21(DE3)pLysS就不長
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但這個結果我覺得不能證明我的蛋白有致死性
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03/05 13:06, , 39F
因為如同我文中所講 pLysS是會抑制insert DNA表現的
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我的盤子上只有抗生素 沒有IPTG 基本上重組蛋白是不會表
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現的
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反而更讓我覺得 應該是有什麼原因 使得plasmid轉不進去
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推
03/05 20:23, , 43F
但是單獨pET20b轉入BL21(DE3)pLysS就會長...
03/05 20:23, 43F
推
03/05 20:34, , 44F
印象中我用的vector好像有6k bps 也是很好轉囧>
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03/06 15:23, , 45F
嗯 我自己做也是這樣 轉pET20b很簡單
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03/06 15:23, , 46F
但是 有insert的轉了就是不會長
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