[求救] PCR 問題
【問題】：
如何找出PRIMER與template的condition
【問題起因】：
現在我有一組sample做為control，在這組control理論上是不會被primer
黏上，也就是應該 "不會有BAND" 出現
但跑出來結果有BAND產生，所以現在想法在於condition問題
以下這想法不確定正不正確
"只要condition合適，不論primer與template是不是在序列上有沒有match
有可能有"一定機率"做出產物"
也就是比如anneling溫度極低，使某CYCLE PCR不小心黏上做出東西
那麼這樣的錯誤就會被放大 (也就是該錯誤變成template，然後做出產物)
基於這樣的想法 (不確定這想法對不對)
要求證，想透過是否有軟體能計算
primer跟template在怎樣的條件下會match並做出primer
我有試過用mac vector，但似乎只會跟你講說
這primer不會match之類
(也有可能我操作不熟，或有我不知的方法)
而我要求的是在怎樣他們才會match，不論條件多極端
【個人看法】：
主要因為我實驗的PCR是在非常低的anneling溫度，想知道這樣條件是否就是問題
而同組control不同次的實驗 (一樣sample一樣condition，差別只在先後)
卻有不同的結果。
再盡力避免人為失誤之下，考慮是污染被放大的情況
也就是不正常環境下的match
感謝各位
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
推
02/21 18:26, , 1F
02/21 18:26, 1F
有試過
我是這樣配置
1.negative controll(不應該有band) ----> dna+ez+.... --> pcr
2. ----> dna+water ---> pcr
3. -----> water
前兩組用的DNA一樣，都是不應該被PRIMER黏上的TEMPLATE
結果是有加enzyne的，做完pcr 有band -------> 不應該有
沒加enzyme是完全沒東西 -------> 正常
所以感覺就是primer不知為啥會黏出東西
可能是tm值問題
但tm值目前是不可能變動，不然實驗組也弄不出來
control條件又需和實驗組一樣，不然不叫control組
所以才想知道有無辦法知啥情況下，本應不該黏上的卻可以黏上
這樣就可以把control去掉
※ 編輯: travelmat 來自: 59.126.67.149 (02/22 11:34)
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02/22 13:32, , 2F
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所以我才想要知道在怎樣的條件下
才會產生這種不該BIND卻BIND上去，而做出產物的情況
我想知道那個CONDITION，比如TM值，或是其他東西
(而我希望有軟體或是更精準的實驗方法告訴我
因為目前為止，同樣的sample同樣的condition卻會出現前一次有東西後一次沒東西
表示非常不穩定，所以我沒辦法藉由比如
45c --> 沒band
44c --> 有band
43c --> 有band
來推測 44度c或許是該值
ps:現在實驗情況是 比如
45c ----> 第一次 沒band ------>第2次 有band ------> .....
44c ----> 第一次 沒band ------>第2次 有band ------> .....
43c ----> 第一次 沒band ------>第2次 有band ------> .....
.....
...
..
而實驗組condition剛好落在中間
以目前比較合理的猜測即是TM值太低
加上PRIMER專一性低
即是Ia大講的部份
所以我才想要找出那個值，或是該問題
※ 編輯: travelmat 來自: 59.126.67.149 (02/22 17:07)
補充一下
我的想法是這樣
今天比較合理的假設就是不專一
(TM值太低；PRIMER專一性不夠；....等等)
但我要先有東西證明
的確今天是因為這樣問題才會有BAND
而不是其他我沒注意
或是我沒辦法排除的因素造成這個東西出現
這樣我才有辦法在實驗中把這項污染去掉
感謝
※ 編輯: travelmat 來自: 59.126.67.149 (02/22 17:11)
推
02/22 20:17, , 4F
02/22 20:17, 4F
上面有提到
有單只跑 DNA+水 跟 單只 水 這兩組
而這兩組都沒事
推
02/22 22:07, , 5F
02/22 22:07, 5F
我同一次操作
一次做兩組 (同樣東西)
分兩次pcr
同台機器，而且聽從同學意見，連pcr機裡放的well都一樣
前次跟後次就是不一樣
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如果是ez buff dna water .... 等等汙染的話
應該沒道理
同樣實驗同樣操作
前次有汙染，後面卻沒汙染
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/23 00:04)
感謝上面各位大大
幫我想辦法
小弟在這邊先謝過
萬分感謝
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/23 00:07)
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做這目的應該是
1.汙染來自dna ---->則用水取代dna時 就不會有band出現
(當然前題是我要先確定此dna跟PRIMER的確是不MATCH的，同時還需
另一組乾淨dna做check)
2.汙染來自水 ----> 則用水取代dna 卻還是有band出現
我上面有提到我有做一組
dna+水 下去跑pcr當control ------> 沒band出現
所以有可能為:
1.水跟dna沒汙染
2.或是有污染但因為沒ez，primer...等等把他放大
接著看我平常實驗的CONTROL
dna+water+ez+primer.....等等
卻會有前次有污染，後次卻沒汙染的情況
所以會變成為
1.如果是 這些內容有污染，在每次都有混勻的情況下取樣，應該結果都是一樣
要馬都污染，要馬都沒污染
(我知道如果直接跑一管以水取代DNA，仍加PRINER，EZ會比較直觀
但就現有資訊應該也可以得證 ?)
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02/23 11:49, , 12F
02/23 11:49, 12F
交叉污染的意思是比如a管dna污染到b管dna嗎?
可現在CONTROL組跑出的BAND大小跟實驗組不太一樣 差了約200bp
而且主要在於汙染應該是不可逆的
也就是污染了就污染了 (除非他degray)
這樣就無法解釋 為甚麼同樣實驗 多次實驗下來 前後結果會不一樣
另外想請問HEK大大
你提到 "用non-targeted DNA做NC太容易有意外。"
因為小弟實驗目前是這樣
有組DNA叫 RV
我將這DNA拿去做bisuilfite處理
(DNA序列上的 C會轉變為T (U)， 但如果這C上有被甲基化，則依然保持C)
暫稱 RV(B)
因應序列前後的改變 ( RV----->RV(B) )
我設計了一組 "序列改變後"的primer
也就是理論上他只會和 bisulfite處理過後的DNA進行binding
RV(B)
此時我設計了兩組control
pos+ control:
利用另外一組PCR primer從RV上P出一段DNA
因應PCR product "不會" 有甲基化的情況
因此把這段P出來的DNA進行bisulfite處理
則此DNA序列上的C 必然 會轉變為 T(U)
(此處排除轉變不完全因素，有別組control來排除這因素)
(PS 這邊使用的PRIMER和實驗組 primer不同，這邊的primer match的是
非bisulfite的序列，單純用來做出一段沒有甲基化，且包括我感興趣片段的
DNA片段)
所以利用這組當POS control
也就是假設我的實驗組中
的確有這片段，同時處理bisulfite成功，則band size應該會和 +control一樣
(確認DNA中是否有這片段還有另一步驟duoble check
bisulfite處理成功 也還有另一步驟duoble check)
NEG- control:
拿原始RV DNA做為control
也就是處理bisulfite使他序列改變"前"的DNA
因應primer設計是以 "處理過後" 的DNA序列
= RV(B)
因此RV理論上是不可能被binding
目前我是這樣設計的
但HEK大大提到的我剛剛有想了一下
的確non-target negative control有很多問題
我自己想到的有這些
1.沒BAND不一定就等於 他不會bind
2.-control 有BAND也不代表 實驗組的BAND是錯的
想請問HEK大大有沒有比較好的方法可以提供給小弟
萬分感謝
也非常謝謝其他大大
真的非常感謝
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (02/23 13:44)
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02/23 13:06, , 13F
02/23 13:06, 13F
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (02/23 13:47)
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (02/23 13:54)
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02/23 23:39, , 14F
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02/23 23:42, 17F
謝謝樓上各位
我決定重頭再一次把SMAPLE ，水...等等全部check一次
(其實已經check過兩次了= =)
先排除污染
如果不行的話接著在考慮 non-target control 這部份
@ace大
很不幸的這步只是我實驗的第二步....
後面還有更麻煩的>"<
當初有考量到兩段序列 (即處理前跟處理後的序列) 非常相近
即使bind的位置有特別選過，但又加上tm值問題
會出現這情況似乎也是可預期的
但目前實在想不到其他方法可以替代
加上自己實驗室跟周圍實驗室沒人用類似方法做此類實驗
無從問起
paper在這部份又會忽略
加上現在paper都用kit做這種實驗= =
所以只能自己一步一步try
真的非常感謝各位大大
祝各位實驗順利 :)
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/25 10:50)