[求救] 將建構好的質體放入expression host

看板Biotech作者 (紫)時間12年前 (2012/02/15 18:37), 編輯推噓7(7推 0噓 20→)
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小弟現在碰到一個很奇怪的問題 就如同標題所說 我將建構好的質體(pET20b + insert DNA)用電穿孔的方式放入BL21(DE3) 但是做了三次都沒成功 而且質體使用的量是一次比一次多 第一次用3ng 第二次用15ng 第三次用30ng 我回頭去測試competent cell是不是有問題 所以使用沒有insert DNA的pET20b 結果使用3ng的pET20b就長了整盤 請問有人碰過這樣的狀況嗎 該怎麼解決呢? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.122.198.162
推
02/15 19:48, , 1F
insertin seq的方向性是否正確？用RE切切看
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推
02/15 23:00, , 2F
沒成功是指沒表現?還是沒長colony?
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推
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若是沒長...我覺的是你表現的protein有毒性
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推
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ng?? 希望你只是筆誤
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樓上覺得ng哪裡奇怪?
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推
02/16 18:18, , 6F
transform的方式有很多種 也不一定要用電穿孔阿
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推
02/16 18:23, , 7F
依據你的說法competent cell是沒有問題的 我覺得要
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不要檢查你的序列 還有insert以及vector對應的enzym
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e或是去看看序列當中是否有你enzyme的切位 有時候
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primer也有可能不小心設計錯喔~因為我就有過這樣的
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教訓
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insert的方向應該是沒有問題的 我是用兩個不同的RE切的
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沒成功是指沒長colony沒錯 我也覺得可能是protein有毒
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但是我使用了BL21(DE3)pLysS當host 但還是得到一樣的結果
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使用沒有insert的pET20b當control就有長菌
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有insert的pET20b就沒長菌
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ng單位是沒寫錯的 一般我看到的protocol也是用ng
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我的經驗也是 只要使用1ng的plasimd就可以長整盤的菌
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使用電穿孔的方式是因為實驗室大部分都是用這種方法
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序列檢查的部分我確實還沒做 我們老闆是覺得能夠表現重組
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蛋白之後再去確定序列是否正確
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我想不通的地方是 明明plasmid是從XL1-blue裡抽出的
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但放到BL21(DE3)卻沒辦法長 我一開始一直以為是vector
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上的antibiotic gene壞掉 但應該不是
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推
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可能你的蛋白有毒 promoter又關不緊 可以嘗試在培養基中
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加入抑制promoter表現的東西 或是換一下培養的溫度
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降低他的表現量或許就會長出來了
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