[討論] 請問做western收phospho protein的方法
我是將細胞種在10 cm dish
準備要用western看很多種phospho protein
因此特別擔心phosphatase的影響
打算使用iNtRON出的protein extraction solution
另外添加Roche出的protease inhibitor和phosphatase inhibitor
之後再以超音波破細胞儀來收protein (不使用冷熱交替法)
並且使用刮細胞的方式收細胞,不過懸浮的細胞protein我也要收起來
查到兩種常用的protocol,但是都有其缺點>"<,不知道該用哪種
Protocol A:
1.收集培養液至離心管
2.在dish中以PBS wash兩次,收集至離心管
3.離心,去除上清液
4.在dish加入200 uL protein extraction solution
5.刮下細胞,收集至同一離心管
6.超音波破細胞
缺點:細胞收不乾淨,若最後再用PBS wash並收集,
則會降低protein extraction solution濃度 (買來就是1X,不能再稀釋)
Protocol B:
1.直接在培養液中刮下細胞,收集至離心管
2.在dish中以PBS wash兩次,收集至離心管
3.離心,去除上清液
4.在離心管中以PBS wash一次
5.在離心管加入200 uL protein extraction solution
6.超音波破細胞
缺點:細胞在無phosphatase inhibitor下刮除
可能導致細胞破裂進而使protein去磷酸化
請位各位覺得哪個protocol比較好,有沒有改進辦法呢?
感謝回答 :)
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