[求救] 又是ligation

看板Biotech作者 (伊諾)時間12年前 (2012/02/07 16:38), 編輯推噓5(5推 0噓 12→)
留言17則, 8人參與, 最新討論串1/1
大家好~ 又是ligation的問題要麻煩大家了 這次是學妹遇到麻煩了 vector:8k多 insert:一共有四組,有兩組700多bp,一組800多bp,一個200多bp compentent cell:DH5α (不過是自己做的) restriction enzyme:NcoI (單點切) vector用酵素切完後,會用CIP處理 從膠上切下來,用kit純化,回溶在水中 切的時間4hr以上或是overnight都有 insert切完之後,也是用kit純化 之後回溶在水中 切的時間同vector 之後做ligation 16度,overnihgt V:I的比例是跑膠後,學長會給建議 所以比例都不太一定 然後transform 但是做不出來 之後再接到TA上 從TA上把insert切下來 但這裡有一個問題 TA clone的plasmid都是用傳統法抽的 濃度也都蠻濃的 之後用酵素切一切,不知道為什麼回收後的濃度都很淡 和vector進行ligation(比例一樣聽學長建議),結果一樣失敗 反覆做了幾次,都接不上去 可以請教各位版友,還有沒有什麼神技呢?? 謝謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.94.249 ※ 編輯: ennnnno 來自: 140.116.94.249 (02/07 16:41)
推
02/07 17:20, , 1F
1.勝任細胞測過效率嗎 差1-2個log就決定有沒有colony
02/07 17:20, 1F
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02/07 17:21, , 2F
2.insert回收濃度多少 有跑過電泳確認嗎
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3.V：I比例多少？ 學長建議是什麼條件
02/07 17:21, 3F
1.勝任細胞效率10的六次 2.insert回收濃度都很淡,直接跑膠check,幾乎是快看不見的那種 (load1μl) 3.v:I我就不清楚了,學長是依跑膠後的亮度去看的
推
02/07 17:21, , 4F
ligase是哪家的?!
02/07 17:21, 4F
ligase 是NEB的
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02/07 17:22, , 5F
4.作不出來是指都沒有菌落還是挑起來再抽都不是接好的
02/07 17:22, 5F
有時候都沒長,但有長的也挑不到= =
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02/07 17:22, , 6F
5.有作自接的control嗎？
02/07 17:22, 6F
自接的control是沒做... ※ 編輯: ennnnno 來自: 140.116.94.249 (02/07 18:16)
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02/08 15:15, , 7F
check E.coli competency at leat 10^5/microgram plasmid
02/08 15:15, 7F
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02/08 16:22, , 8F
ligation buffer確定一下ATP還有沒有效率
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02/08 16:23, , 9F
重複冷凍解凍常會失效.換一罐buffer試試看
02/08 16:23, 9F
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02/08 23:49, , 10F
提高DNA的濃度吧
02/08 23:49, 10F
推
02/09 02:15, , 11F
建議試試看用KIT抽的plasmid做酵素剪切吧~我也曾經遇過用
02/09 02:15, 11F
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02/09 02:18, , 12F
傳統法抽的去切，雖然plasmid原始濃度比較高，但切完回收
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02/09 02:18, , 13F
效率就是比較低...
02/09 02:18, 13F
推
02/09 02:30, , 14F
還有依我自己的經驗，這種有可能自接的ligation，insert比
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02/09 02:33, , 15F
例要比普通ligation要高一點，成功機會比較高。
02/09 02:33, 15F
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02/10 09:46, , 16F
謝謝K大~
02/10 09:46, 16F
推
02/12 17:01, , 17F
傳統法抽的plasmid其實純度比較差 不然kit怎麼賣..
02/12 17:01, 17F
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