[求救] PCR又mutant了....

看板Biotech作者 (蚊子)時間14年前 (2012/02/04 18:37), 編輯推噓7(7推 0噓 15→)
留言22則, 13人參與, 最新討論串1/1
最近要做重組蛋白 所以就是用自行設計的primer去夾cDNA 大量產PCR產物 然後與TA vector做ligation再送到菌裡養大量 抽plasmid後送定序 目前已經做過兩次 每一次都有出現mutant而無法繼續做下去 第一次用的是波士特的Taq組 30 cycle 第二次用的是DaKaRa DRR001A Ex Taq 25 cycle 已經改用具有Proof reading功能的Taq了還是定出四個mutant........ 請問板上有沒有人可以給我點建議或是告訴我哪個好用的Taq polymerase咧? 拜託了T^T -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.129.122.205
推
02/04 19:20, , 1F
可以考慮加一點pfu做proof reading,就很好用了
02/04 19:20, 1F
推
02/04 19:57, , 2F
太長的話還是別Taq吧
02/04 19:57, 2F
推
02/04 20:17, , 3F
用phsion
02/04 20:17, 3F
推
02/04 20:55, , 4F
我現在是用fermentas的CloneJET PCR cloning kit
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02/04 20:55, , 5F
是用blunt end ligation，所以可用phusion等不易出錯的
02/04 20:55, 5F
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02/04 20:56, , 6F
enzyme. 太長的insert用taq很不保險~
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02/04 21:33, , 7F
phusion +1
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02/04 22:05, , 8F
phusion +1 或至少 blend Taq
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02/04 23:21, , 9F
Sigma AccuTaq LA我做5kb PCR沒問題
02/04 23:21, 9F
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02/05 10:44, , 10F
你會不會是clone toxic的protein 有遇過在clone
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02/05 10:45, , 11F
toxic protein到非表現型E. coli 只有mutate的才有
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02/05 10:47, , 12F
toxin時到DH5a時 只有mutate的才會長colonies
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02/05 13:58, , 13F
樓上,DH5a其實不是"非表現型E. coli",它還是會表現你的蛋白
02/05 13:58, 13F
推
02/05 21:09, , 14F
用Pfu ultra
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02/08 09:42, , 15F
你所謂的mutate了是什麼? 跟database序列有4個不符?
02/08 09:42, 15F
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02/08 09:45, , 16F
有時候是物種差異 如果不同template都那4個不同 就是SNP啦
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推
02/10 01:20, , 17F
或是alternative splicing
02/10 01:20, 17F
推
02/15 13:18, , 18F
請問你的產物大小多少呢?我的經驗4.7k用phusion還ok
02/15 13:18, 18F
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02/15 13:18, , 19F
超過的話 我推薦Roche一組expand long template PCR
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02/15 13:19, , 20F
kit 名稱我忘了 但是它號稱可以P到20K 我自己那時候是
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02/15 13:19, , 21F
來P6.2K的東西 定序OK送細胞測活性也OK唷 不過ROCHE那
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02/15 13:20, , 22F
組是taq+具有proof reading的enzyme就是了
02/15 13:20, 22F
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