[求救]為何都測蛋白質濃度了,跑出的western band

看板Biotech作者 (pobatin)時間14年前 (2011/12/15 16:54), 編輯推噓6(6020)
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發問時請注意,若是要問實驗相關的問題,請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 實驗為測定核質分離的蛋白質濃度(細胞實驗),但每次測完蛋白質濃度,western跑完膠後,理當不同時間點未加藥之控制組的核內蛋白表現量應該一致,可每批細胞跑出來的表現量卻是不一致,internal control則和目標蛋白表現量的趨勢是一樣的,其也會受影響, 但沒有細胞質蛋白的汙染.不知道未什摸會這樣 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.163.67

12/15 17:49, , 1F
重新定量一批吧 有可能是定量出錯了
12/15 17:49, 1F

12/15 17:49, , 2F
你的意思是internal control也會隨著給藥而有變化?
12/15 17:49, 2F

12/15 17:50, , 3F
你用的internal是 ?
12/15 17:50, 3F

12/15 18:33, , 4F
我猜是histone H1
12/15 18:33, 4F

12/15 18:35, , 5F
原PO的意思應該是希望不加藥的細胞不同時間點
12/15 18:35, 5F

12/15 18:36, , 6F
internal control 做出來要一樣? 測濃度的方式是?
12/15 18:36, 6F

12/15 19:14, , 7F
測蛋白質濃度本來就是參考~另外搞不好藥本身對internal
12/15 19:14, 7F

12/15 19:14, , 8F
control就有影響
12/15 19:14, 8F

12/15 19:59, , 9F
sample夠 也捨得花的話 個人覺得先跑一次Normalize再跑一次
12/15 19:59, 9F

12/15 20:00, , 10F
比較準-..-
12/15 20:00, 10F

12/15 21:00, , 11F
用BCA測定, 核內intrnal用過laminB, actin但都會受藥影
12/15 21:00, 11F

12/15 21:05, , 12F
收了很多次沒有加藥的控制組,於不時間點的蛋白
12/15 21:05, 12F

12/15 21:07, , 13F
但每一次測到的結果都不同,蛋白濃度測定也都準阿
12/15 21:07, 13F

12/15 21:08, , 14F
理論上控制組於不同時間下目標蛋白的表現量應該是一致
12/15 21:08, 14F

12/15 22:59, , 15F
破核的detergent有沒有超過BCA的容許濃度?
12/15 22:59, 15F

12/16 00:11, , 16F
load膠load的不準?定完量稀釋得不好?先看看藥對internal
12/16 00:11, 16F

12/16 00:12, , 17F
control的影響有沒有濃度相關性來決定是否是人為疏失造成的
12/16 00:12, 17F

12/16 11:57, , 18F
DTT算變性劑嗎? 主要是利用鹽離子濃度破細胞
12/16 11:57, 18F

12/16 11:58, , 19F
同一批樣品重複跑出來的結果是一致的,所以應該不是load
12/16 11:58, 19F

12/16 12:00, , 20F
不同次收的sample,跑出來的結果都不一樣
12/16 12:00, 20F

12/16 12:02, , 21F
其實不只是internal, 而是那整條lane的蛋白量都變少
12/16 12:02, 21F

12/16 12:02, , 22F
因為transfer完,會用Ponceau S染膜
12/16 12:02, 22F

12/16 12:03, , 23F
很明顯那整條lane蛋白都變少
12/16 12:03, 23F

12/16 13:15, , 24F
要注意蛋白質濃度的偵測上限以及用BSA做標準曲線。
12/16 13:15, 24F

12/16 13:18, , 25F
我是用組織 會稀釋50x 且用lysis buffer當sample的blk
12/16 13:18, 25F

12/16 13:18, , 26F
或是蛋白質transfer不完全
12/16 13:18, 26F
文章代碼(AID): #1EwRNN6x (Biotech)