各位板友大家好，小弟並不是生科本科系的學生，
目前正好碰到一些困擾，希望板上的各位能夠給予一些方向與建議，十分感謝!
小弟目前正在試圖突變自己實驗室所分離菌株(非E. coli)之某個功能性基因，
所使用的方法依照paper上所提到的方式是以送入plasmid做double crossover之交換，
使chromosomal DNA上的該片段產生一段inframe deletion(序列codon有調整過，
可做出有功能之蛋白質。)
為了達成這個目標，小弟先從NCBI上找到同屬同種菌株的genomic DNA序列，
接著從中得到目標基因的保守性區域後設計primers，是有成功得到所需要的基因片段，
不過後來從此菌株的細胞調控得知，該基因會同時受到兩種機制去影響其表現，
所以就算突變了chromosomal DNA上的片段，此片段也會受到另一個機制影響而不表現，
使得小弟想要測試之突變蛋白無法正常合成。
有鑒於可能出現這種情況，目前想要以送入overexpression之plasmid替代chromosome，
於chromosome轉錄受到抑制時仍可合成該突變蛋白。
不過現在出現幾個觀念上的問題，
(1)想請問大家一下，送入plasmid的時候要怎麼樣控制該plasmid是要double crossover，
還是要做over-expression？送進去要做over-expression之plasmid是否會跑去形成
double crossover而消失？
(2)想請問如果要做over-expression之plasmid，是不是一定要先調出目標基因的全長？
若要調出全長，目前從NCBI資料庫上是可以稍微設計出最靠近5'end和3'end的primer，
但是此PCR primers在設計軟體上所模擬的效果並不好，Tm差距有點大，3'end的
primer也有出現hairpin loop的可能性，小弟想了另外幾個方案，一個是先用inverse
PCR找出5'end和3'end的上下遊基因序列，在設計較好的primers得到目標基因全長，
而從中又延伸出一個疑問，從目標基因延伸出的5'end與3'end多餘序列是否會影響
over-expression的蛋白質表現？另一個方案則是抽取mRNA進行RT-PCR得到該基因的
cDNA，但要如何選中目標基因的mRNA？進而進行RT-PCR呢？
上述這些大概就是小弟全部能擠出來的想法了，還希望各位能夠把我錯誤觀念的地方提點
一下，也希望各位能給小弟一些額外的建議，讓小弟能夠克服這個困難。十分感謝!!!!
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