[求救] cloning已經做了5個月...

看板Biotech作者 (紫)時間12年前 (2011/11/14 15:07), 編輯推噓9(9推 0噓 49→)
留言58則, 13人參與, 最新討論串1/1
我一共有四個gene要clone 用的plasmid是pET20b RE site用 NdeI 跟 XhoI 在primer設計上 已經把RE site加進去 且在RE site前面多加兩個G 但一直沒辦法把insert接進去 後來改用TA cloning(但最後還是要把gene放到pET20b裡...) 將PCR product clean up後 直接用基龍米克斯的TA cloning kit 將PCR product跟TA vector進行ligation transformation後 做藍白篩 有clone到其中一個gene 但 藍白篩的偽陽性很高 我挑六顆白色的菌 卻只有一個有我要的insert 其它都只有TA vector 另外 我想問 自製的competent cell 要怎樣做才堪用阿? 我做了兩三次的competent cell 但是前兩次的都不能用 transform完跟本不會長菌 第三次做的competent cell時長時不長... 還有 到底怎樣做cloning成功的機會比較高阿? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.122.199.39
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NdeI只多兩個bp恐怕不夠
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你有測試一下competent cell的效率嗎?
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11/14 16:32, , 3F
可是我學長他用NdeI也是多兩個G就可以做得出來@@
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competent cell 就是有用過positive control 也不會長
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我老闆是說 自製的competent cell 過程要快
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但光是分裝就要分幾十管 怎麼快得起來...
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推
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真的不夠快，就去冷房做。
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competent cell的buffer可能要檢查一下，是用CaCl2?
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我們lab是用電穿孔 所以製作competent cell的buf.沒有用
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沒有用CaCl2 是直接用10%的甘油
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推
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competent celll沒有那麼難做 你可能需要更換可靠的protocol
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推
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同意樓上,以前一次常常做50管以上都沒甚麼問題
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推
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我也覺得很好做....
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我也是用10%甘油的...
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推
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restriction enzyme有時候真的很難講...
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明明加的東西、切的東西都一樣，不同次作效果就是會不同
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我覺得接到TA clone之後再切比較保險
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另外藍白篩的時候，可以把plate放進4度冰箱
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過一陣子你說的偽陽性colonies就會變成藍色了
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RE site多的bp有點少耶
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推
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我不知道你一管裝多少 以前lab做都是上百管一次做的
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所以速度不是最大問題 我倒覺得問題可能出在前面的步驟
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或者更可能最原始拿到的sotck菌已經有問題了 所以一路錯
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另外電穿孔的機器條件設定你有確認正確嗎?弄錯也是掛歐
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11/15 12:24, , 25F
更可靠的competent cell protocol有人可以提供嗎?
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我現在就是在用TA clone 但是成功率還是很低...
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我是有發現放四度C有些白的菌落會變藍色 但大概要放多久
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11/15 12:27, , 28F
我知道RE site前多的bp確實是有點少
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但多了幾個bp就真的做得出來嗎...?
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stock菌是學長給我的 品系是XL1-blue有什麼方式可以確認
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stock對或錯嗎?
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11/15 12:33, , 32F
電穿孔的機器設定上應該是沒問題的 positive control有
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長出很多菌
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感謝各位提供的意見
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XL1-blue好像有抗tetracyclin? 可以試一下
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推
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長出很多菌是有多少菌？ 每0.1ng DNA要長出100個colonies
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才能用來作ligation喔！
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推
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也許重點在基隆米克斯...........
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台南米格虜
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boyo這個id好像有點眼熟...該不會是PTT的那個名人吧@@
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11/16 21:52, , 41F
話說 基隆米克斯的東西有什麼問題嗎??
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推
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他的意思是你的kit可能有問題 可以商界別人家的kit試看看
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11/17 10:16, , 43F
一般PCR product做TA clone成功率應該不低才是正常的
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competent cell protocol我都參考molecluar cloning做的
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感覺comptent cell問題比較大....
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11/21 14:03, , 46F
competent cell是一個大問題沒錯 我一直摸不著頭緒
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到底我做的competent cell是哪邊出了問題
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那我現在在參考molecular cloning的方式 正在嘗試
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那TA cloning的部分 我之前用的competent cell是學長做的
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也確認過他做的competent cell是可以用的
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只是效率應該是沒有到0.1 ng DNA 長100 colonies這麼高
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但在做ligation & transformation後 還是可以長出菌落
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可是 藍白篩中卻有很高的偽陽性 問題到底出在哪...?
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11/21 22:39, , 54F
原po在做TA clone時 insert前後有沒有加A阿？
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11/21 22:41, , 55F
還有去除vector的磷酸根可以防止self-ligation
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11/22 11:58, , 56F
A應該是有加 我是用Taq polymerase 理論上應該是有
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11/22 12:01, , 57F
vector是買kit的 裡面的plasmid是linear form的
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11/22 12:04, , 58F
應該也是有用phosphatase處理過的才是...
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