[討論] 抽取組織RNA的步驟

看板Biotech作者 (3D正夯~我是3D鳥)時間14年前 (2011/10/14 00:11), 編輯推噓4(4推 0噓 15→)
留言19則, 4人參與, 最新討論串1/1
我跟我同學是跟不同學姐學抽RNA的技術 我們使用的藥劑也都幾乎相同 但是現在在準備實習課時 卻發現我們的步驟與ㄧ些小技巧不太相同 不曉得是否會有影響 因此上來請教一下大家 以下是抽取RNA的步驟 1. 取小塊的組織，加入500ul Trizol與少量鎬珠均質 2. 均質到無塊狀組織後，再加入500ul Trizol混和均勻，冰上靜置10min 3. 12000g，4度C，離心10min 4. 吸取上清液與100ul BCP混和，再12000g，4度C，離心10min A:vortex 15sec，室溫下靜置10~15min，再重複此步驟一次 B:vortex，冰上靜置15min 5. 吸取上清液與500ul isopopenol，輕搖混勻，-20度C overnight 6. 12000g離心10min A:室溫的離心機 B:4度C離心機 7. 倒掉上清液，使用DEPC水配製的75%酒精清洗(-20度C的酒精)，再12000g離心10min A:倒掉上清液，只用酒精潤洗，重複此步驟一次 B:使用酒精將pellet沖散到看不到 8. 倒掉酒精後讓其pellet air dry，加入DEPC水回溶 A:讓pellet半乾，仍有點濕潤加DEPC水回溶，使用55~65度C乾熱板加熱 B:放到全乾，接者加入DEPC水回溶，使用65度C水浴加熱 是否可使用真空乾燥機? 9. 測核酸濃度，並進行DNA digestion Q:260/280有時大於2.0，為什麼會這樣呀? Q:跑膠的時機是在digestion前還是後呢?兩個都有聽過耶 10.DNA digestion後進行DNase Inactivation5min，接者離心 皆使用ABI DNA-free kit DNase Inactivation Reagent是使用白色微粒 A:Inactivation時輕彈管壁後在室溫下靜置 B:Inactivation時輕彈管壁後在冰上靜置 C:Inactivation時vortex後在室溫下靜置 11.吸取上清液後測核酸濃度，轉cDNA -- ※ 發信站 :批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.184.26.55
推
10/14 01:10, , 1F
步驟跟我們lab的也很不一樣 不過就我而言 如果是組織我會
10/14 01:10, 1F
→
10/14 01:11, , 2F
盡量on ice 尤其不好抽的部位 不過如果跑膠quality很好的
10/14 01:11, 2F
→
10/14 01:12, , 3F
話 放室溫也沒影響了不是嗎? (我是cell line 室溫抽 tiss
10/14 01:12, 3F
→
10/14 01:13, , 4F
-ue 全程on ice) BTW 跑膠和260/230 or 280 沒有絕對關係
10/14 01:13, 4F
→
10/14 01:13, , 5F
我的經驗是都要看 但跑膠重要些
10/14 01:13, 5F
跑膠這步驟 學姐是說可跑可不跑 如果是要做clone就一定要確認quality 但260/280一定要看 太差的就要重抽
推
10/14 01:40, , 6F
8.可以真空抽乾，但時間要拿捏好，太乾可能很難溶解
10/14 01:40, 6F
→
10/14 01:41, , 7F
9.1大於2.0，以前有聽說這可能是酒精殘留造成的結果
10/14 01:41, 7F
→
10/14 01:42, , 8F
9.2應該前後都要跑，才能確定RNA狀況及DNase處理狀況
10/14 01:42, 8F
→
10/14 01:43, , 9F
10如果你說的是resin的話，我之前是在5分鐘輕拍保持它懸浮
10/14 01:43, 9F
→
10/14 01:44, , 10F
如果不曉得會不會有影響，最好的方式就是都抽一次再一起比
10/14 01:44, 10F
→
10/14 01:47, , 11F
我覺得你可以參考一下原始的protocol...再討論被改過的地方
10/14 01:47, 11F
"260/280 ratio>2是酒精殘留"--->這說法我有聽過，但是找不到來源耶 所以有點存保留態度 另外 不曉得你說的"5分鐘輕拍保持它懸浮" 是一直一直輕拍 沒有靜置的動作嗎? 至於參考原始protocol 操作前我有看產品的protocol 但是有些字眼其實很模糊 像是wash.mix well.incubate 因此就產生了不同的做法
推
10/14 01:51, , 12F
加Trizol均質後在室溫離心應該是沒問題的，這時各種酶都變性
10/14 01:51, 12F
→
10/14 01:52, , 13F
但是去掉Trizol後就要注意了。
10/14 01:52, 13F
加了DEPC水不是也可以抑制RNase嗎?? 有的步驟是寫說"room templature" 離心就要改成低溫嗎? 甚至於我還聽到學姐說 protocol上的室溫其實是on ice的意思 因為全程本來就應該on ice (那麼某些步驟刻意寫on ice或者4度C的意義是...?)
→
10/14 22:08, , 14F
TRIzol的protocol好像是寫15-30度都可以吧..忘記了
10/14 22:08, 14F
→
10/14 22:12, , 15F
我有試過比較室溫和on ice, 在我們的樣本是沒差
10/14 22:12, 15F
→
10/14 22:14, , 16F
我自己抽TRIzol時它寫室溫我就室溫，4度就4度
10/14 22:14, 16F
→
10/14 22:15, , 17F
但RNA還是要看樣本，我想有些樣本可能比較難處理
10/14 22:15, 17F
看來還是照著產品protocol最安心 可能每個人都有自己的改良方法 結果一直流傳下去就越改越多了
推
10/15 09:41, , 18F
加DPEC水不能抑制RNase，它是確保你加進去的水無RNase
10/15 09:41, 18F
→
10/15 09:41, , 19F
DPEC在滅完菌之後就沒了
10/15 09:41, 19F
這部分真是我很大的疏忽耶! 我剛才查了一下DEPC水的功用 才發現原來我一直觀念錯誤 我還以為"DEPC水"可以當成去除RNase的噴劑 還想說買那種貴鬆鬆的噴劑幹嘛 ※ 編輯: birdddd 來自: 115.43.43.95 (10/16 00:40)
‣ 更多 birdddd 的文章
文章代碼(AID): #1Ebms_Z9 (Biotech)