[求救] western小分子蛋白壓不到QQ

看板Biotech作者 (咩)時間12年前 (2011/10/12 15:44), 編輯推噓3(3推 0噓 38→)
留言41則, 10人參與, 最新討論串1/1
我的實驗蛋白分子量6 kDa,抗體可觀察到的分子量約15KDa 一抗建議濃度1:100-1:1000 二抗1:2000-1:10000 mouse anti-goat 實驗中: blocking 5% milk; transfer是commerical buffer(無外加methanol) 70V 1hr [第一次]一抗1:1000 (in 5% BSA) 二抗1:10000 (in 5% milk) 主要的band完全空白,雜band [gradient gel 2分鐘] http://ppt.cc/lLN; [12% SDS gel 10 分鐘] http://ppt.cc/FZ1I [老師建議]一抗1:100 (in 5% BSA) 二抗 1:10000 (in 5% milk) 用15% SDS gel跑了之後,(跑一半就收,所以沒有把小分子跑掉的疑慮) 結果不僅10分鐘的雜band很微弱,連我所要看的band都壓不到 因為抗體改成1:100,不知道是否是因為一抗太濃呢? 這個東西壓不出來,題目就做不下去了QQ 請達人幫幫我~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 125.224.237.33
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10/12 15:46, , 1F
qPCR gap 16 cycles; target 22-25 cycles
10/12 15:46, 1F
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10/12 16:07, , 2F
qPCR +1,會不會是抗體品質問題? 保存期限過期?
10/12 16:07, 2F
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10/12 16:47, , 3F
上面的qPCR是我做的,所以覺得都22cycles,怎麼還會壓
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10/12 16:47, , 4F
不到,抗體是剛買的SC牌
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10/12 16:49, , 5F
倒底在問PCR還是WB? 怎麼上面幾個都在講 cycles?
10/12 16:49, 5F
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10/12 16:50, , 6F
還有 transfer是哪一種 semi-dry? 還是 濕式
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10/12 16:50, , 7F
另 "跑了"一半就收 跑是指 running不是transfer吧?
10/12 16:50, 7F
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10/12 16:51, , 8F
如果是running跑了一半 好像跟有沒有transfer過去 沒有關係
10/12 16:51, 8F
謝謝 cin: 因為我先做qPCR,再做western, 所以猜想qPCR可detect到22cycles 應該不會WB看不到. transfer是溼式, SDS gel running到一半是怕小分子跑太快會先跳海 ※ 編輯: spirithorse 來自: 125.224.237.33 (10/12 17:20)
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10/12 19:06, , 9F
有mRNA 也不見得一定會有protein就是了
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10/12 19:12, , 10F
我看您貼的兩張圖 我認為是transfer跳海
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10/12 19:13, , 11F
不用看bands 請看一條條的背景 小分子的位置 連背景都沒了
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10/12 19:13, , 12F
我推測是小分子在transfer跳海
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10/12 19:14, , 13F
transfer時 每個分子都是像火車過山洞一樣
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10/12 19:15, , 14F
要讓想要的分子之車箱 剛好停在membrabe山洞中
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10/12 19:16, , 15F
那該分子的車廂多寡(量多) 速度(分子小較快 膠濃又慢一點)
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10/12 19:17, , 16F
都要考量 再調一下條件吧
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10/12 19:20, , 17F
最好有positive control 才知道 不是該蛋白沒表現
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10/12 20:25, , 18F
改用 NC paper 試試看
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10/12 20:26, , 19F
或是PVDF泡 methanol 時泡久一點,水洗一下就泡到
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10/12 20:26, , 20F
transfer buffer
10/12 20:26, 20F
謝謝以上的建議! ^^* ※ 編輯: spirithorse 來自: 125.224.237.33 (10/12 20:53)
推
10/12 21:25, , 21F
建議可以換0.2的PVDF,其實NC對蛋白質的binding capacity較差
10/12 21:25, 21F
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10/12 21:35, , 22F
謝謝! 明天我會去查實驗室用的PVDF種類QQ
10/12 21:35, 22F
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10/12 22:56, , 23F
一般PVDF都是0.45um, 0.22um的也許可以試試看
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10/12 22:58, , 24F
NC paper 在我的經驗中"解析度"會比較好
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10/12 23:01, , 25F
你要觀察transfer後,同(或小於)分子量的maker還在不在
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10/12 23:18, , 26F
我用的最小marker size 10KDa 是綠色很淡,15KDa看的到
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10/13 02:08, , 27F
借題請教 有人說transfer的時間太久 蛋白會穿過NC或PVDF
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10/13 02:08, , 28F
所以效率反而變差 這是真的嗎? 有相關的說明工具書嗎
10/13 02:08, 28F
推
10/13 04:10, , 29F
是真的啊 任何免疫染色的工具書都會說吧
10/13 04:10, 29F
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10/13 04:11, , 30F
1. marker 選用最小 band 比你要看的東西更小的
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10/13 04:12, , 31F
2. 整張 membrane 拿去 coomassie blue 染一下
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10/13 13:29, , 32F
昨天怎麼落了一個字母!?糟...
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10/13 13:30, , 33F
transfer過頭很容易發生在較小的蛋白質上
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10/13 13:32, , 34F
如果你要的是小分子,那大分子的marker可以不用管他
10/13 13:32, 34F
推
10/13 18:30, , 35F
覺得transfer過頭 +1 如果實驗室沒有0.22的PVDF
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10/13 18:32, , 36F
也暫時不想買 放兩張0.45 就可以知道有沒有transfer過頭
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10/13 18:34, , 37F
如果真的在第二張PVDF看到10kDa marker和你的protein
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10/13 18:34, , 38F
再去optimize transfer condition
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10/13 18:36, , 39F
可以調整電壓及時間 但我覺得最有效的是加MeOH在buffer裡
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10/19 23:59, , 40F
映像中..transfer buffer 的MeOH含量提高有助於小分子
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10/19 23:59, , 41F
的transfer (10%~20%)
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