[求救] 想問一下板上有沒有人使用過Promega的點突變kit

看板Biotech作者topkofaxion (Cid Hsieh)時間14年前 (2011/10/04 10:01)推噓7(7推 0噓 15→)

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想問一下板上有沒有人使用過Promega的這套kit GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Cat.# Q9280) 最近實驗遇到了瓶頸... 我老闆希望我的論文能夠再補做一些點突變的data 因此下令我去負二十冰箱中找出那套已經過期一年的kit(當初是要給學長做的...結果人\ 跑了) 只不過明知道已經過期很久但我老闆還是希望我能試試看,不然丟了也浪費(資金有限...) 因此我也只好硬著頭皮做 = =" 這套kit可用在所有帶有抗ampicillin gene的plasmids上(應該幾乎都有) 首先是要將雙股DNA變性為單股再用Mutagenic Oligonucleotide(primer)去跟單股DNA來 annealing (兩段primer,一個為我的insert,一個是在ampicillin上) 接著再用T4 DNA Polymerase與T4 DNA Ligase來做成完整的雙股DNA 此時的plasmid一股是正常的,另一股是突變過的先將synthesis與ligation過後的plasmid拿來做transformation 用的是mismath repair minus的 E.coli strain 然後養在LB medium 並加入kit當中所附的antibiotic selection mix (上面講到的另外一個primer就是為了將原先的ampicillin gene做修改, 改過的gene除了抗amplcillin之外也能抗他所附的antibiotic selection mix) overnight之後抽plasmid 此時的plasmid為normal跟mutant的混合所以接著再做第二次的transformation 用的是JM109的 E.coli strain 接著塗盤在含有amplcillin與antibiotic selection mix的plate 最後挑colony定序目前實驗還卡在第一步的denature跟transformation denature的步驟是照protocol的方式先用強鹼反應五分鐘後再用酸來中和接著加酒精沉澱然後用TE buffer回溶DNA 然後跑膠確認只不過我跑膠的結果跟手冊上說的很不一樣上面寫說單股DNA跑得比較快而且會出現smeared的現象不過我跑膠的結果卻是出現分子量大很多的band,也沒有smeared 做了三次都是一樣的結果鹼跟酸的溶液也是重配過確定pH值反正也沒想太多就繼續往下做transformation...... 結果~ overnight culture都沒有長,LB還很清澈,然後kit中附的control plasmid也一樣沒有長目前已經有照troubleshooting中的方式減少antibiotic selection mix的量然後competent cell也確認有辦法在沒有抗生素的plate上長起來剩下我能想到的原因就是那兩個enzyme了怕他放太久已經沒有活性了想問問板上大大還有甚麼意見跟方法嗎??? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.130.104

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milkpa

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