[求救] real-time PCR 試劑問題

看板Biotech作者 (BLUE)時間14年前 (2011/09/03 13:38), 編輯推噓1(1推 0噓 9→)
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小弟實驗室的real-time PCR機器是用ABI step one plus 之前是使用Roch的reagnt 最近剛換了一家新廠牌的SYBR green reagent (KAPA SYBR FAST qPCR kit, Master Mix 2X ABI Prism) 發現在melt curve中會出現 double peak 起初以為是primer 汙染 , 但是在做檢測時發現(primer重泡) 就算是negative control (只load 水) 不只有melt curve 還會有一般的螢光訊號 (28-30的cycle附近) 要說這是汙染 為免汙的量也太大了吧 目前是還沒去將p出來的產物拿去跑膠 想請問各位先進, 除了primer汙染之外,還有什麼其他的因素會有可能造成這個現象 ps我記得業務有說過他們家的這個reagent SYBR green下很重 ,所以訊號都會很強 但跟我這個結果有關係嗎= = 以上 感謝各位幫忙解惑 ^ ^/ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.67.246
推
09/03 14:59, , 1F
我只加 template or 只加 primer set 都沒有訊號
09/03 14:59, 1F
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09/03 23:04, , 2F
忘了說我是用 KAPA Universal Reagent
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09/03 23:47, , 3F
你的 negative control 是指沒有 template 嗎？
09/03 23:47, 3F
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09/03 23:48, , 4F
還是全部都是水 給機器去讀？
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09/03 23:51, , 5F
要先排除掉是primer dimer的可能性 才考慮background
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09/03 23:52, , 6F
KAPA我之前用在bio-rad的機器 效果還ok 沒什麼問題
09/03 23:52, 6F
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09/04 02:52, , 7F
N大,yes只load水和primer with reagent (no template)
09/04 02:52, 7F
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09/04 13:10, , 8F
你的internal control是否也有兩個波峰？
09/04 13:10, 8F
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09/04 13:11, , 9F
若沒有 可能是target gene引子設計或黏合溫度的問題
09/04 13:11, 9F
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09/09 16:57, , 10F
就污染 不用太相信廠商
09/09 16:57, 10F
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