[求救] His-tagged protein 純化方法
我使用的column是Sartobind IDA 75
欲純化的protein為His-tagged EGFP protein，6xhis-tag接在EGFP的C-ter.
用2xLB medium養菌並且induce後抽取cell lysates的上清液，上清液呈現明顯的綠色
用藍光激發後可觀察到明顯的綠色螢光
因此我想純化出存在上清液中的EGFP protein
Sartobind IDA的原理是利用iminodiacetic acid來chelate二價離子再利用二價離子去抓
histidine
我使用的buffer分別如下：
Equilibration buffer (100 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH4.5)
Charging buffer (0.5 M NiSO4 in ddH2O)
Washing buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH8)
Elution buffer 1 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH8)
Elution buffer 2 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH8)
以上buffer均先過0.22 um filter
Loading的順序如下：
10 mL ddH2O -> 10 mL Equilibration buffer -> 10 mL Charging buffer ->
10 mL Equilibration buffer -> 10 mL ddH2O -> 10 mL Washing buffer ->
5 mL sample -> 10 mL Washing buffer(每 1 mL 收一個fraction)
-> 5 mL Elution buffer 1 -> 5 mL Elution buffer 2 (每 1 mL 收一個fraction)
結果如下：
Sample flow-through 的濾液呈現明顯綠色，藍光激發後有明顯的綠色螢光
Washing fraction #1-#3 用Nanodrop spectrophotometer測A280有吸收值
藍光激發後有綠色螢光，其餘則在A280的吸收值很低且無綠色螢光
Elution fraction A280的吸收值全部很低並且全無綠色螢光
請教一下各位大大
這樣的方法哪裡有瑕疵嗎
基本上完全是依照user manual的protocol
可是從結果看來，EGFP protein應該是完全沒有被Ni2+抓住
雖然尚未做Western blot來確認
但從A280的值看來Elute出來的fraction幾乎是沒有protein的存在
麻煩各位了
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