[討論] PCR product size

看板Biotech作者 (FENOR)時間13年前 (2011/08/05 22:14), 編輯推噓2(2推 0噓 18→)
留言20則, 6人參與, 最新討論串1/1
這其實算是遇到過比較神奇的問題， 當初預計要PCR的gene ORF有大約600bp， 最後PCR出來卻只有大約300，結果接起來送定序居然是全對的。 其實比較好奇的是:有其他人遇到過類似的問題嗎? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.135.165
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08/06 21:27, , 1F
300 bp 接起來 送定序 變 600 bp 全對?
08/06 21:27, 1F
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08/06 23:46, , 2F
沒頭沒尾的要討論啥?
08/06 23:46, 2F
就是PCR出來的產物，在agarose gel上對marker之後， 顯示的size只有300bp多一些，可是後來還是把這條band切下來接近vector去， 最後送定序回來的結果卻是整個gene 600bp都有接進去。 ※ 編輯: FENOR 來自: 140.112.135.165 (08/07 03:28)
推
08/07 08:28, , 3F
跑錯marker? 對錯marker圖? 你有把接進去的切下來看過嗎
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08/07 17:44, , 4F
樓上一針見血
08/07 17:44, 4F
當時同時跑的還有另外兩個gene，對起來的size是沒問題的， 所以我想不是對錯marker圖。 至於接近去的切下來跑，跑一跑還是在300多，這個gene發生的事情困擾我蠻久的， 畢竟其他的gene並沒有類似情形。 ※ 編輯: FENOR 來自: 140.112.135.165 (08/07 19:30)
推
08/07 21:16, , 5F
多了一個RE site?
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08/07 22:06, , 6F
我比較好奇當初PCR-gel看到300bp,怎麼還會想接進vector？
08/07 22:06, 6F
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08/07 23:03, , 7F
marker是純化的DNA fragment PCR product鹽濃度高 可
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08/07 23:04, , 8F
能是其中一個問題。另一個問題是300跟600在1%以下gel
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08/07 23:05, , 9F
很接近。其他因為GC contain 應該不會差到一倍
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08/07 23:05, , 10F
除非你的DNA有結構上的問題
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08/07 23:08, , 11F
不然就像lanthegood說的 RE會切到你的insert DNA
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08/07 23:24, , 12F
上面打錯 是content
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08/07 23:52, , 13F
我也很好奇看到300怎還會想接回去看@@?
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08/08 02:32, , 14F
可能是純興趣吧 有時候未知的fragment我也會clone
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08/08 02:32, , 15F
然後定序看是什麼 畢竟現在做這不貴
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08/08 08:39, , 16F
一般的TAE或TBE本身的鹽濃度都高到不太會有這種差異
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08/08 08:39, , 17F
除非妳是用SB或是LA這種很不鹹的buffer system
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08/08 08:40, , 18F
還有600左右的dsDNA有辦法造成結構問題...?
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08/08 08:41, , 19F
還有樓上 我的唉滴開頭是i XD
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08/08 14:17, , 20F
我眼殘 orz
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