[求救] 抽miniprep還可以 養來抽maxi就不見了

看板Biotech作者 (平安夜 失身夜)時間14年前 (2011/07/06 23:19), 編輯推噓1(1推 0噓 11→)
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材料: DH5a competent cell (commercial) pLV hPGKGFP EFS-HA lentiviral plasmid, ~10Kb Terrific Broth +Amp 100ug/ml 方法: 1. plasmid ransform E.coli overnight,37度約14hr 2. 收盤後挑clone養2ml TB+Amp, 200rpm, 37度約14hr 3. 收菌, phenol check, 抽mini RE check 4. 200ul菌液加到100ml TB+Amp, 錐形瓶shake 200rpm, 37度約14-16hr 5. 收菌, phenol check, miniprep. 問題出現了. 觀察與問題: 1. 只要是這支vector plasmid長的colony都非常小顆 2. 抽mini的結果不太穩定, Nanodrop的圖沒異常但讀值不準, 260/280都落在1.9 拿去跑EtBr膠後product乾淨但跟讀值很明顯對不起來, yield跟其他plasmid比差蠻多的。 3. 菌在TB或LB都長得很好, 小量抽起來還足以應付實驗但拿去養大量後幾乎沒有yield 心得: 1. 拿到plasmid時學長就有說這plasmid比較難搞, 繼代後表現很差 (學長表示這無法凍起來當stock,我想是否也表示養大量效果很差?) 2. mini成功率較高我認為是因為clone夠fresh 3. 這支plasmid我已經用很久了但因為mini就足夠實驗需求所以還好 4. 沒map, 是跟別人要的別人沒畫圖, backbone是pLV,網路查到的都是high copy number 5. 網路上剛看到討論, plasmid/GOI如對E.coli有影響,colony會很小, 即使promoter是Euk.也很難說.可能的解決方法是做實驗菌要fresh, Amp不要太濃25-50ug/ml, transform時DNA用少量(<1ng,pg等級)等等 6. 本人+博6學長mini, midi, maxi都頗有經驗, 抽過大大小小plasmid很多,就這隻很奇怪。 7. 試過一些冷門方法, 比如加chloramphrenicol, 徒勞無功, 最近會再試其他想法 因為最近要做天殺的electroporation 光用mini做實驗會很拮据 希望大家能給我些意見... 延畢後期這節骨眼可以的話我很不想換vector... -- 有悟性的人，就讓他計算天團的數字， 因為這是神的數字，它的數字是五千五百六十六。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.55.238
推
07/06 23:56, , 1F
要馬用Stbl3做，要馬就多挑些colony，養大量時多加點
07/06 23:56, 1F
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07/06 23:57, , 2F
pre-incubated菌液。pLV跟pHR系列都殘障殘障的。
07/06 23:57, 2F
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07/06 23:58, , 3F
至於chloramphenicol...，這不是另一種抗生素嘛 @"@
07/06 23:58, 3F
沒錯, 藥理上是抑制peptide生成 但也常用來提高low copy plasmid的產量 我記得Molecular Cloning有寫 只是應該很少人需要用吧 哈
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07/07 00:06, , 4F
步驟3~4之間,你200ul菌液應該不是fresh,是放著等mini ok?
07/07 00:06, 4F
我也試過不等先馬上丟去養大量 再check確認丟下去的有Plasmid 但養出來救試沒有 而且我想相對其他步驟的時間 那mini的時間不怎麼影響freshness
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07/07 10:50, , 5F
in stead of Amp, try carbenicillin, which is more stable
07/07 10:50, 5F
謝謝大家的意見 這期間我才知道不只我在lentiviral plasmid上碰到這問題 還看到別人的問題有 LTR 跟 recombination 真的很詭異 (目前的菌號稱幾乎沒有recombination, 因為recA deletion etc.) 尤其ace大提的stbl strain 我才知道有專門針對這個的E coli... ※ 編輯: Realthugz 來自: 140.109.55.238 (07/07 17:15)
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07/08 00:38, , 6F
兩個方法,1.直挑數顆midi, o/n凍pellet,先取1cc mini test
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07/08 00:40, , 7F
或2.將溫度一律改成30度,check mini同時丟100ul到100ml o/n
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07/08 00:42, , 8F
我有顆帶有9kb基因的vector,國外lab給的建議就是用30度,不
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然,連circular的塗盤也永遠挑不出正確的
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07/08 00:48, , 10F
也有4.5kb基因的,只要是o/n後mini剩下的,再去o/n都掉光光
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07/08 00:53, , 11F
最後才知有些construct就是這麼麻煩,每次都要先mini check
07/08 00:53, 11F
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07/08 20:41, , 12F
stb1＋1
07/08 20:41, 12F
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