[求救] 有關純化蛋白的問題

看板Biotech作者 (就只是大叔而已)時間14年前 (2011/05/19 14:08), 編輯推噓5(5推 0噓 2→)
留言7則, 6人參與, 最新討論串1/1
我用的是pichia表現系統 按照invitrogen的protocol plasmid是pPPIczα 在小量表現的時候收連續三天induction的medium做western blot 用anti-his抗體去認 可以認到有dose變化的single band 可是問題在大量表現後 收medium 過Ni-colum後 上AKTA 用0.5M imidazole 沖出 大概在40-50%的時候會有peak出現 收fraction後跑western blot 一樣用anti-his抗體去認 結果就斷得亂七八糟了(每個位置都有band 還是smear的) 有可能是imidazole的關係嗎 因為我有把大量表現indution三天後的medium收一些下來跑western blot 結果還是正常的single band 所以再想應該是純化的過程有問題 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.98.126
推
05/19 23:35, , 1F
我覺的會不是 Ni-colum 沒有純化好?
05/19 23:35, 1F
→
05/20 10:33, , 2F
樓上是指ni和蛋白發生某種作用了嗎?
05/20 10:33, 2F
推
05/20 15:41, , 3F
會不會是過colum的時間長 蛋白被某種proteinase水解啊?
05/20 15:41, 3F
推
05/27 14:54, , 4F
1.純化產物有雜蛋白且抗體亂黏 2.也可能是protease水解→
05/27 14:54, 4F
→
05/27 14:55, , 5F
請改用protease deficient strains ex. pichia SMD1168
05/27 14:55, 5F
推
05/30 00:17, , 6F
Yeast表現系統 一般不建議使用His-tag...background太高
05/30 00:17, 6F
推
06/13 21:36, , 7F
收完medium你有馬上純化嘛？還是只是4度c冷藏
06/13 21:36, 7F
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