[求救] real time PCR 結果不穩定

看板Biotech作者 (沒口德的人還真是多)時間14年前 (2011/05/18 12:13), 編輯推噓1(1推 0噓 11→)
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各位大大好 最近做real time PCR的時候遇到了一些問題 使用的機型是Roche Light Cycler 480 probe 是使用Taqman hydrolysis probe 每個sample都做三重複 RNA的部分是由T7 RNA polymerase轉錄出的cRNA 一共有7種不同序列的cRNA RNA 的 OD 260/280都有1.8以上 每個cRNA smaple都做10倍系列稀釋 上周做1~4號的cRNA結果都很正常，稀釋1000倍的sample Ct值大約都在13左右 但是這週做5~7號的cRNA 稀釋1000倍的sample Ct值卻跑到30上下 想請問各位大大 在實驗條件跟reagent的都相同的情況下 還有甚麼原因會造成這種狀況呢? 謝謝~ p.s.補充一下，我是用cRNA系列稀釋之後做one-step real time PCR， 然後7個cRNA sample的濃度都在1.8ug/ul左右。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.95.218
推
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妳在反轉錄前有定量嗎??
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反轉錄前倒是沒有進行過定量，我是抽完plasmid後拿一點
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去跑電泳，亮度夠就直接拿去做反轉錄了，因為7個clone
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都是同時抽然後同時跑電泳，然後同時進行反轉錄，所以我
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不太懂條件都相同的狀況下為什麼有三組就做不出來 @@
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拿去轉cDNA的濃度沒定量就不相同啦
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@@可是我7個cNDA clone轉出來的cRNA濃度都在1.8ug/ul
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左右，因為7個cRNA sample的濃度都差不多，可是卻有3個
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跑出來的Ct值差異很大，所以我不清楚問題是出在哪 Q_Q
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※ 編輯: steerboss 來自: 163.25.95.218 (05/18 15:14)
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05/18 19:33, , 10F
cRNA保存在那個地方？ 會不會是cRNA degradation，
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樣本有剩，就再做一次同時間1-7號樣本的One step QPCR
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cRNA保存在-80冰箱
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