[求救] 最近的ligation很難搞...有人有好建議嗎?

看板Biotech作者 (軒)時間13年前 (2011/04/28 12:27), 編輯推噓17(17推 0噓 38→)
留言55則, 10人參與, 最新討論串1/1
最近在接3個construct 不是大片段就是blunt end 接了快3個月了還是接不出來>< (快被老闆逼瘋了...) 又不能換接的方式 (因為前人是這樣接要比較...) 實驗室用的是NEB的T4 ligase 16度C overnight 爬文有看到用4度C處理的會比較好嗎？ 不知道版上的先進們有沒有什麼好建議..orz ------------------------------------------------------------------ (1) 1700 bp insert 接 12k vector insert已先clone好於TA vector上 cutting site設計BamHI+HindIII切下 感覺應該沒什麼困難...但就是接不起來.... ------------------------------------------------------------------ (2) 5.4k vector 接 8.4k vector 將2個vector用KpnI一刀切開後互黏成將近14k的plasmid 2個vector抗不同抗生素 因此2種抗生素同時篩選能長的應該就是接成的 但都不長..... ------------------------------------------------------------------ (3) insert 950 bp 要deletion序列中間片段 7 bp 所以設計primer夾出該片段以外2側的片段(150 & 800 bp) 2片段外端在primer上各別設計BamHI和EcoRI cutting site (因為PCR後要digestion因此有多設計2bp, NEB說BamHI/EcoRI只要1bp就能切..) digestion之後2片段與 4.7k vector做 ligation (有處理PNK讓PCR片段+磷酸根) 想接成vector/EcoRI-----╡(blunt end, deletion的片段)╞-----BamHI/vector 我本來是想中間再設計一個cutting site分2次接 但老闆堅持這樣一定接的起來 而且說這是promoter怕多出cutting site序列影響transcrip 但怎麼樣就是接不出來啊~~~~~~ ------------------------------------------------------------------ 以上 我想如果要仔細找問題的話會有很多地方要討論會很複雜~"~ 所以想先請問看看這樣的一些construct 有沒有一些撇步或特別的方法or該注意的地方呢?? 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.115.48.144
推
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Ligation的水是否乾淨？
04/28 14:05, 1F
推
04/28 14:18, , 2F
你的insert都好長啊......其實光看這樣的內容 不太能幫你
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04/28 14:19, , 3F
建議什麼,少了很多資訊,許多實驗條件都沒講(不方便透漏則
04/28 14:19, 3F
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04/28 14:19, , 4F
另當別論) 希望可以多一點有用的資訊 好讓大家集思廣益
04/28 14:19, 4F
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04/28 14:34, , 5F
我們這的水是先RO在二次去離子水...然後滅菌後使用...
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04/28 14:35, , 6F
是沒有不方便透露啦^^"只是我怕每個都打太詳細會太複雜
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04/28 14:36, , 7F
想說主要的方向先打出來...不知道該多提供些什麼資訊好??
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推
04/28 14:40, , 8F
如 insert : vector 的比例,反應溫度時間 等等..
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04/28 14:42, , 9F
反應都是20ul 16度C overnight第一組有試過3:1 5:1都失敗
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第二三組的話...一個因為2段都是vector 一個有三段...
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所以都是取差不多等量(1:1 3:3:1)下去做~"~
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推
04/28 14:56, , 12F
blunt end ligation 本身就比較困難 試試看 5:5:1 記得要
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做 control組
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第二組 可能兩個vector自接的狀況會很嚴重,至少挑一個
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vector做一下CIP或SAP, 比例不要用1:1
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第一組的 insert真的頗大,7k....有辦法拆成兩段嗎?
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1.7k啦 XD 1700 bp
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抱歉,看錯~1.7K應該還好...
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請問上面說的control組是指..plasmid? 還是其他的control?
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推
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試試quick ligase，室溫5分鐘搞定
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推
04/28 20:22, , 21F
趕時間我試過丟進37度一小時 直接transform 這是邪道
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不過7K insert真是贏了
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恩..應該說我主要想問的是接大片段&blunt end的秘訣XDDD
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推
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blunt end就 Vector CIP一下看看囉
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推
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1跟2有試過轉型這麼大size的效率如何嗎？另外2應該複製ori
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04/29 02:14, , 26F
不同吧？3的話應該是用pfu PCR吧～然後想問一下若用pfu PCR
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還需要磷酸化嗎？？我以為他P完會有磷耶...
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你做的size都很大喔～～祝你好運～～
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有試過轉空的12k vector ok 然後需要PNK是爬文說PCR完沒有磷 0.0
推
04/29 02:19, , 29F
我在想第二組是不是讓他recovery時間延長一些 畢竟要製造
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04/29 02:20, , 30F
兩種抗生素 bac.也要有足夠體力
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第一組 接不起來是說跑膠沒有band嗎?? 有時候就直接丟下
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去transform 也可以吧
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目前是SOC recover 1 hr 接不起來是要嘛不長 要嘛就只有空vector ligation後跑膠嗎?! 這我沒試過耶... 因為以前學長是說跑膠也只能看到insert vector的band 接成功的plasmid量太少看不到...
推
04/29 09:34, , 33F
第二個好酷 可是一個plasmid有兩個ori不會怎樣嗎
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04/29 14:09, , 34F
ori不同就可以，所以有那種穿梭質體阿
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※ 編輯: shenhsu 來自: 140.115.48.144 (04/29 15:21)
推
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還是你要不要試試ligation產物進行PCR~就拿vector primer
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PCR insert~這樣至少確保ligation沒問題
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跑膠也是可以啦～應該可以看到不同構型～但也要DNA夠濃
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才看的到不同的構型
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推
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拿vector primer PCR insert <= 請問是什麼意思？
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推
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就是insert如果有成功跟vector連在一起，我們可以用靠近
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insert處的vector序列，設計primer往內PCR~就可以P出inser了
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例如pUC19的M13F/R 或者pGEM-T的T7/SP6
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對了，定序質體的insert通常都用這些vector定
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就是從promoter F跟insert R去夾 就定序的方式囉
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推
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嗯...不過如果有做CIP的話就P不出來吧
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推
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還是可以阿～是PCR ligation產物～iverse PCR有類似的原理
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拼錯～是inverse PCR
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推
04/29 23:39, , 48F
CIP之後得到的ligation產物是nicked DNA
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PCR第一步denature的時候，產物會變成linear form
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斷在想要P出來的片段中，應該P不出來吧？
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推
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我的意思是～ligation如果有成功會接成circular，通常CIP只
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作vector，insert不做。所以insert可以跟vector接起來
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這樣用vector的primer 往insert PCR，不就可以P出含有insert
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的部份～
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05/13 19:54, , 55F
用羅氏的ligase試試看
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