[求救] 如何做懸浮性細胞的免疫螢光染色?
請問大家一個問題.
假若養懸浮性的細胞 (例如自然殺手細胞,NK cell)
如何把這樣的懸浮性細胞固定在cover slip上之後,然後做IF(免疫染色)
我們有試過將NK cell貼在poly-lysine coated cover slip (BD)
直接把NK cell加在poly-lysine coated cover slip上,5小時
然後細胞的確會黏上去 (但會ㄧ團一團)
之後照以下步驟去做IF,如下:
1. 用prewarmed PBS洗2次
2. 以3.7% Formalin固定15min
3. 以PBS (含0.2% Triton X-100)打洞,5min x 3次
4. 以blocking buffer (PBS+5% BSA)室溫blocking 1hr
5. 1抗 (1:50 diluted in blocking buffer),室溫1-2hr (或 4度C overnight)
6. 以PBS洗,5min x 3次
7. 2抗 (Cy3-labeled anti-rabbit IgG, 1:100稀釋),室溫45min-1hr
8. 以PBS洗,5min x 3次
9. 然後以正立螢光顯微鏡觀察
奇怪的是:
1. 細胞都會ㄧ團,然後在顯微鏡下看都沒有焦距
2. 背景有點髒 (有點紅或有點綠)
3. 細胞內的目標物都看不到 (我們是在看Perforin)
不曉得根據以上的步驟,可能會是什麼原因呢?
以及,不知道大家都怎麼做懸浮性細胞的IF呢?(都是:貼附-固定-染色嗎?)
希望有人可以幫忙解答
謝謝
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