[方法] 關於Caspase3和PARP的Western以及細胞週期相關問題

看板Biotech作者 (FUJI0904)時間14年前 (2011/04/11 12:09), 編輯推噓6(6推 0噓 19→)
留言25則, 6人參與, 最新討論串1/1
各位先進，小的有個問題想請教 最近剛做完藥物MTT的實驗，接著要轉到看Cell cycle的部分 老闆的意思是，如果SubG1有明顯增加的現象，就要看藥物是否引起 Mitochondrial apoptosis，所以接著要看 Caspase3 或 PARP 的活化與否 在MTT中可以很明顯的在 24 h treat 後看到 cell viability 下降 而在cell cycle上禮拜跑的結果卻發現相較 control組，SubG1 並沒有明顯增加 反而有 arrest 在 S phase 的情形，有同學在做 cell cycle 的跟我說，讓我延長作用 時間 因為如果可以發生 arrest，之後有可能就走進 apoptosis，這件事是對的嗎？ 之所以不染 Annexin V 只是因為老闆覺得太貴，之前學長用完就不想再買了>"< 另外，由於之後可能要做 caspase3 和 PARP 的 WB 所以我問了學長姐，結果得到這兩個 protein 都不好染 尤其是在 whole cell lysate 的狀況下，由於表現量本就不高，不是很好做 讓我有點心慌，我就稍微去查了一下，發現壓得很好的 data 沒有提細節 有提細節做法的其實 data 也不清楚 我有看到有人的論文提及他們在做 WB 時會每個 well loading 30~50 ug 的 whole cell lysate，跟一般一個 well 不會超過 20 ug有點不同，不知是否為了解決表現 量比較少的問題？ 有沒有人有相關經驗可以指點迷津的？ 我學長是有說 PARP 可以直接抽核蛋白，增加每單位體積中 PARP 濃度... 但caspase3就不知該怎麼辦了... 懇請指引我一盞明燈吧!!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.117.39.44
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04/11 13:45, , 1F
caspase-3我記得不難壓欸...雖然很久以前的事= =
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推
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caspase 3跟PARP都不難壓,我也都是whole cell lysate
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well loading 20~40ug,表現量都很多
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推
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兩者皆可用whole cell lysate
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04/11 19:22, , 5F
謝謝樓上諸位的見解^^，我想再問一下，我知道
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pro-caspase3還算好看，但因老師不喜歡以pro的減少當作
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活化，還是希望看到cleavaged form，請教這兩種蛋白的
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04/11 19:24, , 8F
cleavaged form也會跟pro一樣明顯嗎?
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推
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cell signaling的cleaved caspase-3很好壓
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推
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嗯...以前用IMGENEX的casp-3 pro跟cleaved都有
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感謝大家^^，我們實驗室的好像是cell signaling的
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不知道能不能請教一下kaka大的條件呢?
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因昨天同學去壓，用我們實驗室的條件，cleavaged form
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非常不明顯...學長非常認同這樣的結果...囧rz
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我們是loading 20 ug 的 whole cell lysate
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感謝kaka大
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推
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我們家是用ZYMED的抗體,壓出來的Cl-casp 3也很明顯
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loading多一點或抗體濃一點試試看XD
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我之前也是用cell signaling，同樣pro-明顯.cleaved不明顯
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據前輩說法，可以試試看從膜中間橫切，分開1抗，會有幫助
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t大的意思是把pro和cleavaged剪開
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然後壓同樣的抗體嗎？ 也謝謝kaka大的回信^^
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我都會試試
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目前也在跑，跑了好多次背景都很高(很髒)，不抱希望的
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把膜放著，洗了三天，今天壓出背景超乾淨的Caspase3
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