[求救] 想請教有做過EMSA的前輩
各位前輩：
我們買了一組EMSA的kit(pierce的)來做RAW 264.7 細胞的NFkB
可是很奇怪的是 我們用LPS刺激細胞後
在WB中可以看的到磷酸化的P65的確有因為LPS的刺激而上升
(且negative control沒有band)
但是做EMSA的時候 相同劑量的LPS刺激相同的時間卻沒有比negative control高很多
(事實上我設想說negative control的位置應該要跟WB的結果一樣 沒有band)
我們有用沒標記biotin的相同序列去做競爭 也的確有被競爭掉(band 消失了)
再更嚴謹一點的用P65跟P50的抗體去做supershift 想證明的確是那條band
不過卻失敗了 加了抗體跟沒加抗體的相比之下沒有差異 位置沒比較高 量也沒少
我已經有寫信問美國pierce公司技術部門
他們給我的回應是 競爭有做 且作的漂亮 應該就是了
只是為何LPS刺激後沒有比control高很多 他們也很困惑
不曉得有做過這個實驗的前輩們能否給我一些意見?
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