[求救] Transfer 200 kDa的protein 效果很差

看板Biotech作者 (XareeLee)時間15年前 (2011/02/07 21:06), 編輯推噓5(5推 0噓 13→)
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我們實驗室之前都是用semi-dry的方式 但是200 kDa常常transfer效率不好 semi-dry的條件: gel: 7.5% acrylamide gel (thickness: 1 mm) buffer: 20% methondal, 192 mM Glycine, 25 mM Tris (沒調整pH,但應在8附近) current: 280 mA duration: 30 min membrane: NC membrane (pore size: 0.45 micron) 試過把methanol降為10% 結果也是一樣！ 我們是用Cell Signaling Technology (CST)的biotinylated marker (#7727)做測試 http://www.cellsignal.com/products/7727.html 140 kDa的marker勉強壓得出來 但是200 kD就幾乎看不到 就算壓到30分鐘也是幾乎沒有 後來改用wet transfer (GenePure system) gel、membrane和buffer的條件一樣 但是current改用300/350/400 mA且duration測試1/2/3 hr的交叉測試 都完全沒有辦法壓出明顯的200 kDa 10% methonal也測過了 也試過增加0.05% SDS到trnafer buffer內 效果都不佳 現在要壓western看 200 kDa的target完全不敢做 因為連marker都壓不出來 做下去只是浪費時間和抗體.... 想問一下有沒有人做過>200 kDa的western blot 能夠提供您的tranfer條件 謝謝！ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.82.62.18 順便問一下大家的gel和NC membrane會泡在transfer buffer內多久呢？ ※ 編輯: xareelee 來自: 111.82.62.18 (02/07 21:14)
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時間拉久一點，先試1.5倍時間看看，protein在膜上其實很
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難被transfer過頭。另外，泡在buffer內5~30分鐘
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NC membrane和PVDF適合的protein也不一樣，構造原理不同
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我是有試過濕式 transfer over-night, 30V 4度C
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fermentas 的marker 250kD 可以, 不過我的target還是測
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不到 , 所以只能給你參考看看囉
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用濕式 加0.1% SDS
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200 kD的protein最好用wet transfer
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推
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我transfer過400kD的，當時是直接卯起來transfer四小時
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不過我的membrane是PVDF的
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而且電流我也只用了80mA
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推
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我的protein 450 kD, wet transfer with 0.2% SDS
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50 V(定電壓) 999 min 冷房操作
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200kD: Towbin buffer, 0 or 10% MeOH, no SDS, 30V 16hr
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OR 100V 120min OR 40V 750min; 請參考
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推
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改濕式的 很有幫助
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請用supersignal Femto ECL reagents 保證一定做出來
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