[求救] 金黃色葡萄球菌突變株之構築

看板Biotech作者garybounce (Bounce)時間15年前 (2010/12/16 17:04)推噓2(2推 0噓 10→)

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在進行金黃色葡萄球菌 staphylococcus aureus ATCC8095(分離自奶油派) 將其spa (Protein A)突變株的構築方法是使用電穿孔將pGEM帶有spa 上下游基因中間插入Tetracyclin抗藥性基因之plasmid 送入菌體當中，希望利用同源性互換的方式突變掉該基因 Protoacal 是參考下列paper Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus FEMS Microbiology Letters Volume 94, Issue 1, Date: July 1992, Pages: 133-138 Steve Schenk, Richard A. Laddaga S. aureus competent cell 製備步驟大概如下 O/N culture-> subculture to OD600約1~2之間 (測過生長曲線，Log phase) 將菌體離心下來後，以去離子水 wash 3次再使用10% gllycerol 以1/10及 1/5體積各wash一次最後進行分裝，每管約有3~6x10^9 cfu 電菌condition: 0.1-cm gap electroporation cuvette 100 ohms resistance, 25microF, 2.3kV SOC medium or LB 養一小時塗盤目前情況是 Negative 都很乾淨不長，偶爾一兩顆實驗組就是兩天的培養，會長大概10顆左右 subculture 也都還是會長但是在PCR 確認時，都amplify是WT的size condition 其實有微調過 DNA loading的量也調過但是都沒有拿到Positive 的transformant PCR check 試過了莫約10次.. 蠻灰心的~~~~~ 因為之後可能也要做其它基因的mutant 現在這個做不出來就令人擔心我看PAPER在S. aureus的mutation 其他人都做得嚇嚇叫不知道有什麼特殊因素是我不知道的嗎? 還是說其實是有strain的限制麻煩有操作過的前輩給盞明燈~~ 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.213.79

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left873

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garybounce

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推

licat

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