[求救] PCR & Western & Cell culture

看板Biotech作者 (KTR衝合歡山)時間15年前 (2010/12/16 00:07), 編輯推噓4(4推 0噓 7→)
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發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 最近小弟在養細胞也在同時做PCR和Western均有發現問題想請教高手 養細胞：培養液跟文獻上的一樣，trypsin的溫度在室溫，作用時間3分鐘。 但還是會有細胞變型的情形發生，從原本小顆的細胞變細長。 PCR：重複以前學長姐的的步驟，PRIMER和溫度和時間都沒錯，目標在大約300 bp， 但有雜band形成，微弱的兩條band出現在600、700左右的位置，會是甚麼問題呢? Western： transfer 電流 250 mA，時間2.5小時， 但Marker只剩下最下面的band被轉過去，用CMB染已轉的膠上沒有蛋白殘留。 現在想說繼續接一抗，偵測有沒有蛋白質過去，但第一次看到這種情形。 想請問有沒有高手可以替我解答，感謝。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.44.210.167
推
12/16 11:54, , 1F
PCR有target band出來就好了不要要求太多 橋溫度時間
12/16 11:54, 1F
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12/16 11:54, , 2F
離子濃度只是跟自己過不去
12/16 11:54, 2F
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12/16 11:55, , 3F
western不是可以丟ponceau S?
12/16 11:55, 3F
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12/17 02:14, , 4F
ponceau S 我們實驗室好像沒有，請問一下大概多少呢?
12/17 02:14, 4F
推
12/17 10:26, , 5F
ponceau S很便宜~且可一直reuse~泡一罐可以用很久
12/17 10:26, 5F
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12/17 19:28, , 6F
一次用一瓶都比你一抗便宜吧= =
12/17 19:28, 6F
推
12/17 21:06, , 7F
細胞會不會是有被黴漿菌之類的汙染了,有些試劑可以檢測
12/17 21:06, 7F
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12/17 21:07, , 8F
PCR我會懷疑是primer不純,直接請廠商重合給你試試
12/17 21:07, 8F
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12/17 21:08, , 9F
Western我覺得可能是沒弄緊,轉的時候蛋白都掉到buffer裡
12/17 21:08, 9F
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12/17 21:09, , 10F
濾紙多夾兩片再做一次(我以前與過類似問題因此解決了)
12/17 21:09, 10F
推
12/22 00:22, , 11F
你 WB "最下面" 指的是分子量最小的？
12/22 00:22, 11F
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