[求救] 限制酶反應產物卡在well處
最近有幾次做RE digestion (Fok1, NEB) (切割對象為600bp PCR products)
跑膠看產物,都發現產量比預期低很多,而且在well下緣卡著頗亮的訊號
今天做出來的更慘烈,發生亂切,切出比理論產物大小小了一半的東東
我的反應條件是:
Final conc. uL/tube
DDW 19.4
PCR product (182.5 ng/uL) 4.47 ug/rxn 24.5
10x NEB buffer 4 1x 5
Fok1 (4U/uL) 4.4 Units 1.1
Steps:
1. 37度c 水浴一小時
2. 65度c heat inactivate 20 min
#這個enzyme的特性是不可切超過1hr 每1ug DNA不可用超過1U
##enzyme和buffer到現在已經用了快半年了,最近一個才開始有這問題
###有一點比較怪異的是,PCR products純化後測O.D.，得到的260/280 ratio只有1.1x
不過因為跑膠結果很正常,我就還是拿來用了
####PCR purification kit是基隆米克斯的
有人有遇過像這種每次digestion不穩定,well卡東西的情況嗎？
我回想過程中比較可能有問題的地方是吸取enzyme的時候,
每次吸這種微量黏稠藥品時都很擔心會不會黏附過量....
不知道有沒有比較精準的吸法
還請大家指點orz 感激不盡
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◆ From: 140.112.4.195
※ 編輯: FDynasty 來自: 140.112.4.195 (12/06 19:44)
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嗯嗯感謝,我今天把buffer全部換新來重做一次看看
比較困惑的是卡well的protein會被SYBR染到嗎...?感覺真的有DNA被"綁架"在well.
※ 編輯: FDynasty 來自: 140.112.52.126 (12/07 10:23)