[求救] PCR結果從正常變成雜band四起
這幾個月來快被PCR搞瘋了...
7月時訂了兩組primer，在質體pBR322上PCR
做gradient後找到了最佳溫度，也成功地做出預期中的single band產物(各為600bp和680bp)
於是開心過暑假，等下學年開學正式開工
到了9月，我把存在-20度冰箱的諸位stocks們重新取出分裝，用同樣條件來PCR時，
卻發現出現好幾條雜bands(都是偏高,大約800,1500附近，強度約是主要產物的1/3)
兩組primer的rxn都是
這讓我不禁懷疑是不是藥品有問題? 於是不停的試，
最後除了primers、template沒買新的(primer一條一萬多，買不下手)，
其他都換新的了
還是一樣。
想請問大家，明明條件完全一樣，隔幾個月就從單一產物變成雜band四起，
通常是什麼原因呢?
藥品壞了?
共用儀器汙染?
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期間唯一一個成功的改良嘗試是在PCR rxn中加入final conc.為50 mM的LiCl,
它讓我產率下降，但是成功消除了雜bands
(註: 之所以用LiCl是因為別的考量，一言難盡，和那個$10000的潛在二級結構有關)
所以近期有想嘗試微調反應條件了....
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補充自己的實驗內容概要
這一部份實驗是純粹DNA操弄，
用兩組primer各批出600bp,680bp的產物，
再將600bp的一邊尾巴用限制脢(Fok1, NEB)切一刀(切下20bp)，和680bp ligate在一起。
(之所以680bp能夠直接拿來ligate是因為它的5端帶有約30bp的extension,是sticky end)
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◆ From: 122.126.48.168
※ 編輯: FDynasty 來自: 122.126.48.168 (12/04 23:19)
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12/05 21:35, , 1F
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推
12/06 08:50, , 2F
12/06 08:50, 2F
那條其實是正常20個mer的primer後方額外接上30mer,
貴是貴在其中兩個位置是abasic site(去掉鹼基),以進行autostick PCR
※ 編輯: FDynasty 來自: 140.112.52.126 (12/06 14:21)