[求救] ligation 的問題

看板Biotech作者 (dj)時間13年前 (2010/11/19 11:10), 編輯推噓14(14推 0噓 26→)
留言40則, 9人參與, 最新討論串1/1
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 我用的材料是 pGEM T easy vector (3K) insert長度大約 2.4K 現在問題是，我加完所有ligation 的solution後 放在室溫約 6 hr後才放進 4度C冰箱....... 請問這樣還有救嗎? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 111.240.131.123
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11/19 11:35, , 1F
試一下囉 ligase在4度活性會降低很多
11/19 11:35, 1F
推
11/19 12:15, , 2F
ligation最好是16度,如果隔兩天才要transform的話,
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11/19 12:15, , 3F
我就放冰箱,隔天要transform就放室溫
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11/19 12:16, , 4F
我學到的好像是差在碰撞機率耶...
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11/19 12:19, , 5F
其實 各家的protocol都不太一樣 有16度 overnight和 4度
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11/19 12:20, , 6F
我是有得到一個答案，室溫可能已經working完了.....
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11/19 12:20, , 7F
在低溫的狀況，ligase的活性較低，因此可以慢慢的ligation
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11/19 12:21, , 8F
以得到最大效率!? 我的思考是這樣 = ="
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推
11/19 12:28, , 9F
pGEM Teasy這套不是rt一小時就可以長一堆嘛？
11/19 12:28, 9F
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11/19 12:34, , 10F
室溫也是可以反應的~ 繼續做吧
11/19 12:34, 10F
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11/19 12:39, , 11F
恩....但是最高效率還是4度C啊 XD 而且我的insert長了那
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11/19 12:39, , 12F
麼一點 有點心慌 XD
11/19 12:39, 12F
推
11/19 12:42, , 13F
這套有沒有4度 ON其實都一樣 最大差別在transform
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11/19 12:42, , 14F
recover的時候SOC跟LB差很多
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推
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室溫一小時就可以了
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推
11/19 13:50, , 16F
做過室溫十分鐘...
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11/19 14:38, , 17F
我在 transform 用的是commercial的comptent cell
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11/19 14:39, , 18F
並沒有用到 SOC，而是直接transform在LB上，樓上的大大
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11/19 14:39, , 19F
是要我另外加上SOC嗎?
11/19 14:39, 19F
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11/19 14:40, , 20F
= = commercial的competent裡面應該就有SOC了吧 XD
11/19 14:40, 20F
推
11/19 14:42, , 21F
................
11/19 14:42, 21F
推
11/19 14:57, , 22F
樓上息怒XD t大指的是medium用SOC比用LB更好
11/19 14:57, 22F
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11/19 14:59, , 23F
所以heatshock完放冰上以後加SOC再incubation
11/19 14:59, 23F
推
11/19 15:04, , 24F
其實如果用heat shock~幾乎不用修復耶! ^^"
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11/19 15:04, , 25F
我都直就塗plate了~
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11/19 15:06, , 26F
所以 我才說 我用commercial的根本就沒有recovery的步驟
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11/19 15:07, , 27F
他heatshock後直接塗在 "預冷"的plate上 (算一種recovery?
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※ 編輯: DJHINN 來自: 140.112.80.2 (11/19 15:10)
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11/19 15:11, , 28F
所以 另外用SOC 處理會比較好就對了 = =?
11/19 15:11, 28F
推
11/19 15:18, , 29F
個人經驗,當年電菌後修復,用LB跟SOC長的colony量差不多~
11/19 15:18, 29F
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11/19 15:21, , 30F
我只是 heat shock啊 XD
11/19 15:21, 30F
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11/19 15:26, , 31F
低溫下annealing會比較好 ligation效率變差
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11/19 15:36, , 32F
低溫下annealing會比較好 ligation效率變差
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11/19 15:37, , 33F
溫度較高下則相反
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推
11/19 15:47, , 34F
我說的soc跟LB是用他附的的comptent cell
11/19 15:47, 34F
推
11/19 15:50, , 35F
而且他也有寫9. Incubate for 1.5 hours at 37°C
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11/19 16:21, , 36F
我用的 是 yeasten的 competent cell....
11/19 16:21, 36F
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11/19 16:28, , 37F
不好意思....我發現...我LA打成LB 了 ...對不起 = =+
11/19 16:28, 37F
推
11/19 21:59, , 38F
搞了半天是yeastXDD
11/19 21:59, 38F
推
11/19 22:02, , 39F
yeasten
11/19 22:02, 39F
推
11/19 22:07, , 40F
這樣應該依照各家廠商的protocol為基準會比較恰當吧
11/19 22:07, 40F
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