[求救] IRES與雙CMV promoter

看板Biotech作者 (Aj)時間13年前 (2010/11/11 17:00), 編輯推噓3(3推 0噓 10→)
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小弟目前在構築抗體載體 想利用慢病毒表現系統(Lentivirus expression system)做大量表現 目前實驗室是以transient transfection 表現抗體 載體為pTCAE 含兩個CMV promoter和兩個MCS 如果要以病毒感染方式 用IRES 和用雙CMV會有差別嗎 如果選用IRES 是以 pCMV-LC-IRES-HC 或是 pCMV-HC-IRES-LC 比較好呢 且paper很多IRES的序列 似乎改善的研究還在持續 有前輩用過覺得不錯的IRES序列嗎? google了相似問題 以下為網路的解答 "IRES效率比較低。 插入目的片段后,IRES後面的報告基因經常看不到熒光 高雙CMV啟動子效率高。兩個CMV啟動子,小心載體內重組。 最好是一個用CMV啟動子,一個用SV40啟動子,或者其它啟動子。" 各位前輩是否認同上述說法呢?? 或是可以指引一些paper讓小弟閱讀 不勝感激~~謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 202.169.162.1
推
11/11 19:49, , 1F
比較常見的是IRES兩端表現量不一。倒不會後面不亮
11/11 19:49, 1F
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11/11 19:50, , 2F
雙CMV的確有recombinant的風險，比較常見的是雙向promote
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11/11 19:50, , 3F
像是pBI系列(clontech吧?)。最近流行2A peptide不是？
11/11 19:50, 3F
推
11/11 20:52, , 4F
雙向的CMV重組機率會比單向的低嗎
11/11 20:52, 4F
謝謝A大的指點 之前有想過要是可以連著做 做完自己會斷成HC LC該有多好 沒想到早就有人做出來了 看來我的資訊update太慢了 看來2A peptide 的確是個不錯的選擇 不過有點疑慮就是抗體前端有signal peptide 不知道2A的殘基會不會影響 另外 小弟有個疑問就是 recombinant是重組去哪啦 就被踢出細胞外了嗎 還是就是在genome間跑來跑去?? 如果已經挑到一個產量高的stable clone recombinant還會經常發生嗎?? ※ 編輯: wkj1020 來自: 202.169.162.1 (11/12 10:44) ※ 編輯: wkj1020 來自: 110.27.107.116 (11/14 00:08)
推
11/15 18:37, , 5F
我不做抗體，所以我不清楚2A peptide殘基影響程度。
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11/15 18:37, , 6F
不過一般CDS表現上並沒有太大差異。
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11/15 18:38, , 7F
recombinant常看到的是mutant form，mapping出來完全不對
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11/15 18:39, , 8F
通常對於repeat seq很多的plasmid我們都會做error rate
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transform或streak out下去，挑30-50個colonies來mapping
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做出來我個人經驗是bi-directional突變率比較低
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2A peptide的運作機制我看過兩種，一說是auto-cleavage
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另一說是ribosomal skipping。基於我沒有偵測到過未切斷
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11/15 18:43, , 13F
的fused protein，所以我猜後者有可能。我猜啦...XD
11/15 18:43, 13F
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