[求救] real time PCR 不穩定的結果

看板Biotech作者 (煌樹)時間13年前 (2010/10/24 20:05), 編輯推噓5(509)
留言14則, 5人參與, 最新討論串1/1
各位大大晚安,希望大家可以幫我一起解決這個問題。 最近我正在做real time PCR,但是結果都不盡理想。 我使用的機型是roach Light Cycler 480,probe 是使用Taq man的系統。每一個sample 我都進行兩重複。 在進行反應時,我在同一個well中同時加入了兩組的primer和probe(reference gene 和target gene,進行standard curve也是同樣)。但是,試了好幾次的結果,通常只有 reference gene的結果是偵測的出來,而且cp值相差不遠,算是好結果。 但是target gene就會呈現偵測不到,或是一個有偵測到,一個沒有。 我想問,為什麼我的實驗結果會這樣,是因為我將兩組的primer和probe混合在一起嗎? 還是有其他原因呢? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.230.71.85

10/24 20:08, , 1F
抱歉,是Roche 我拼錯了。
10/24 20:08, 1F

10/24 20:41, , 2F
關鍵詞:混在一起????????
10/24 20:41, 2F

10/24 20:54, , 3F
就在在同一個WELL中,加入兩個基因的primer和probe
10/24 20:54, 3F

10/24 21:13, , 4F
你的reference是什麼..該不會是18s rRNA吧..
10/24 21:13, 4F

10/24 21:14, , 5F
沒看清楚.是qRT-PCR還是qPCR而已?
10/24 21:14, 5F

10/24 21:24, , 6F
就qPCR,我的reference是 house keeping gene
10/24 21:24, 6F

10/24 21:38, , 7F
只做一般的PCR 35 cycles後看的到target gene的產物嗎?
10/24 21:38, 7F

10/24 21:44, , 8F
我沒試過一般pcr,不過他的CP值大多落在35之後。
10/24 21:44, 8F

10/24 21:51, , 9F
試試增加sample的濃度?
10/24 21:51, 9F

10/25 01:13, , 10F
總cycle數40嗎? 通常cycle數落在30以後線性會比較差
10/25 01:13, 10F

10/25 01:14, , 11F
若你的target比較少 40cy可能不夠偵測 增加10cycle看看
10/25 01:14, 11F

10/25 01:16, , 12F
或是增加template量 35才出來的話可能要增加100倍濃度...
10/25 01:16, 12F

10/25 01:18, , 13F
& 除非sample很珍貴 建議還是不同組分開做比較好
10/25 01:18, 13F

10/25 01:23, , 14F
也有可能pcr條建不適合target那組primer/probe..原因很多
10/25 01:23, 14F
文章代碼(AID): #1Cn23yDT (Biotech)