[求救] 救急 組織螢光染出來是空洞!!
板上各位前輩好
小弟在IF上打轉了許久 但是苦苦找不出問題點...
我們家用的protocol如下:
Animal: Rat(200-250g)
Target: spinal
200 ml warm saline (全速infusion)
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300-400 ml cool 4% formaldehyde( 一開始全速 過一半後降至 1 drop/sec)
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取下要的段落 再切成約4-5mm長度
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泡至4% formaldehyde 4-5hr post-fixation
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換成 30% sucrose solution dehydration
(我知道有paper說用梯度脫水)
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等sample 完全沉降後 取出放至平台切片機(非chamber式 是底座降溫)
加OCT做包埋
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切30um 替換式刀片 大概切2-3組換一片 水冷降溫器顯示為-17度
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以100 mM TBS 做wash 5 mins *6
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使用3% H2O2 處理 30min-1hr, RT
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wash 5 mins *6 unil the bubbles disappear
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Blocking 1 hr with 4% BSA+0.3% triton, RT
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wash 5 mins *2
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Ab' in 1% BSA ,4度C O/N even to 72hr = ="
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wash 5 mins *6
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Ab" in 1% BSA, RT 1hr
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wash 5mins *6
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以毛筆 在玻片上貼片 展片
P.S.
我是以free-floating的方式
從切片下來後的步驟 "wash,H2O2,block"皆於6孔盤2-3ml
接Ab都在24孔盤 200-300ul"
然後染出來的結果就會不對...
我要看的Lamina 1&2卻是暗的
偏偏我用的Ab'是 "PSD95" postsynaptic density 95
http://tinyurl.com/25zh2ao
http://yfrog.com/mqimage7xj
老師跟學長說這東西在neuron上會很多 但是我在dorsal horn就染布出半個neuron的型態
我有懷疑過是染色有問題
但是很妙的是...marker的染色又幾乎沒什麼問題 部分receptor也可染到...
GFAP
http://tinyurl.com/2d3xyk7
http://yfrog.com/mvimage2zij
OX-42 (小的貼片技術還不是很好 固有破損...)
http://tinyurl.com/2bgkuzd
NeuN
http://tinyurl.com/2432eyk
TNFR1:
http://yfrog.com/j3image9bsj
然後最近更棘手...以前可以染到ventral horn的motor neuron
現在都消失了...
motor neuron:
http://tinyurl.com/2corwjq
dorsal上的洞洞(不知道是neuron還是破洞了...):
http://tinyurl.com/29c9275 螢光
http://tinyurl.com/2dmf9a7 一般光
從block濃度改變 Ab' Ab"的titer 接合時間 triton濃度 都試過了
而且我的background一直都很高1/200-2000 的差異 只有光度時間持續長短...
二抗是invitrogen的Alexa Fluor®555 & 488 donkey系列
濾鏡應該是可以濾出要的波長
最近我家老大 懷疑可能脫水不完全造成的破洞 所以小的又要開始著手試新條件
可是每天都在試條件 這樣下去實驗室會倒吧...救命喔!!!
等條件都抓到 我想別人碩士論文都寫完了!!!
拜託板上先進們 拉拔一下小弟吧 @@"
為了這個 我已經好久沒回家睡覺了 哭 每天都在實驗室住 在廁所洗澡ㄒ口ㄒ 拜託了!!
我已經很久不知道床是什麼東西了 請先進們指點一下吧!!!!!
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如果能贏 誰想輸...
如果能成功 誰想失敗...
如果未來會更好 誰還會停滯不前...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.67.245
推
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