[求救] Western 的 band 黏合 + 形狀不佳 (附圖)
大家好，敝人做 Western blot 時
在最近觀察到自己的 beta-actin 常會黏在一起
而不是很 sharp 的分開，下文附圖
我是用老鼠大腦為組織，為了偵測 c-Fos 的表現
50 ug / ml 的濃度（低於 40 ug / ml 就偵測不到 c-Fos）
條件如下
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Loading 前處理 || 加入 dye 後，攝氏 80 - 90 度，煮 5 分鐘
Gel || 8% SDS-PAGE
Electrophoresis || Stacking gel: 80V, RT, 20 min
Separation gel: 130V, RT, ~40 min
Transfer || 400 mA, 冰浴, 2 hr
Blocking || 5% milk in TTBS, RT, 1 hr
Primary Ab || Beta-actin: 1/2500, RT, O/N
c-Fos: 1/2000, RT, O/N
Secondary Ab || Beta-actin: 1/5000, RT, 1 hr
c-Fos: 1/3000, RT, 1 hr
Wash || TTBS RT, 5 min
5 min
15 min
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c-Fos: ~ 60 kD
Beta-actin: 43 kD
http://tinyurl.com/2ewrxvx
這張圖是用 ECL 冷光呈色 270 秒以後得到的結果
可看到 beta actin 的邊緣有所沾連
而且不是完整的扁平形狀（近似Ｗ形鋸齒）
c-Fos 形狀則比 beta actin 漂亮得多
至於 lane 2 東西很少是因為裡面有沒 sonicate 乾淨的 DNA（電泳時就可見到一坨）
http://tinyurl.com/23ucpp9
這張則是 ECL 冷光呈色 250 秒以後得到的結果
beta actin 彼此有分開，但形狀仍然帶有鋸齒
想請教板上各位高手
是否能給敝人一點修改的建議
老闆想拿實驗結果投稿
不過敝人認為這樣子難看的 beta actin 恐怕不太適合當 representative figure
看到壁報上那些乾乾淨淨的 band 心裡就好癢 ~"~
個人在猜想會不會是因為 beta actin 的一抗加太濃??
因為先前有用過 1/5000 的，結果 beta actin 訊號不強
所以後來敝人都是用 1/2500 的濃度加一抗
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※ 編輯: goodfish700 來自: 140.112.121.239 (08/05 21:21)
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