[求救] Sonication 如何確保打斷 DNA
大家好
最近在做 Western blot ，用 sonication 打破細胞時
常遇到 DNA 沒有打碎完全的問題
在電泳時可以看到 sample dye 包著一坨東西"拖著"往下跑
二抗呈色以後也有發現 protein 比旁邊少
我的實驗簡述如下
我是拿老鼠的腦組織（取特定腦區）以液態氮凍起來以後
加入 lysis buffer （配置比例如下）
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RIPA 1000 ul
Triton X-100 10 ul
Protease (PMSF) 5 ul
Protease inhibitor cocktail 5 ul
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一個 eppendorf 裝的組織塊重量平均約在 15 - 20 mg 左右
每管加入 50 ul 的 lysis buffer
之後以 sonicator （廠牌 Fisher Scientific, sonic dismembrator, model 100）
輸出功率為 1 - 10 WATT (RMS)
進行細胞打破的動作（我使用的功率為 2.5 左右）
以 1 Hz 的頻率，破十次，總共重複 5 次，也就是每管會打 50 次
可是這樣子打下去
仍常會發現 sonication 不完全，Western blot 電泳會看到一坨東西
這樣影響我之後的 protein expression 定量的程度還滿大的
最怕的就是 variation 造成統計以後不顯著
可是用動物腦組織最大的技術限制就是
每隻動物只有一個腦，也就那麼點腦區可以用（用顯微鏡取出來不過一個米粒大小）
sonication 打不好，如果是在關鍵區域的組織
那隻就不能用了
因此想請問大家關於用 sonication 來準備動物組織 protein 進行 Western blot
是不是有甚麼建議或經驗可以指教在下？
個人懷疑是有時候因為在破碎組織塊時
eppendorf 埋在冰下看不到
無法掌握 sonicator 的 probe 沒有完全浸入 lysis buffer （有時候啦）
打出氣泡，可能導致 DNA 因此未完全承受到破碎的力道？
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