[求救] 限制酵素double digest

看板Biotech作者 (..)時間15年前 (2010/07/23 13:35), 編輯推噓3(3推 0噓 10→)
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請問各位大大 我現在進行一個基因接上GFP vector的construct 限制酵素切位選擇是以BamHI及Bgl II這兩個酵素作選擇 遇到的問題是, 1)37℃作double digest 2小時 2)37℃ 20小時 將載體作CIP的處理 之後再將產物以膠純化作ligation 16℃ overnight 塗plate後 養菌約14hours都沒有長出任何的菌株 想請教是否因為這兩種限制酵素作double digest沒辦法切動 導致ligation的步驟沒辦法完成 謝謝大家~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.117.91.9
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07/23 13:41, , 1F
之前也是用這兩個怎都黏不起來 = = 切位相同很麻煩
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07/23 13:47, , 2F
這一組是compatible ends就算切動了也會長得一塌糊塗
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07/23 15:01, , 3F
請問長得一蹋糊塗的情況是指什麼情況~目前是菌株都沒長
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推
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insert應該沒CIP吧...XDD
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我的經驗是非常好接 但是要挑方向
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兩個都CIP會接不起來吧 VECTOR已經CIP了
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只有vector有作CIP~請問大大挑方向的意思是?
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推
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因為兩端都接得起來 所以會有正接反接的問題
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你的情況是什麼都沒長 可能的問題太多了
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對阿 所以用這組ENZYME真的是自找苦吃 除非不得已
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推
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有時間的話,分別各自切BamH1和BglI再跑膠和mini比較
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如果有切斷的話,就會看到plasmid size會變
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這樣就可以知道是哪一個enzyme沒切斷了~
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