[求救] 想請問關於transfer大分子量protein

看板Biotech作者 (你還是省省吧)時間15年前 (2010/06/20 01:01), 編輯推噓6(6推 0噓 5→)
留言11則, 7人參與, 最新討論串1/1
我所要偵測的是TrkA (約140 kDa)這個在細胞膜上的receptor磷酸化的程度 但發現無論在怎麼樣都無法偵測到，連未磷酸化的TrkA也無法偵測 後來染膠的時後發現大分子量(>100 kDa)的部分似乎transfer的效果都不好 判斷似乎是因為這樣導致無法偵測到其protein的表現 在調整過各種條件仍無法解決 想請問是否有其他改善transfer效率的方法 或是有沒有人也有做TrkA這個蛋白的表現，想請問是怎麼做出來的? 另外，我們家所使用的是invitrogen的XCell II Blot Module 但我也試過semi-dry的方式，依然無法解決 拜託大家了，謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.42.220.47
推
06/20 01:43, , 1F
try 拉長transfer時間 buffer提高SDS/降低MeOH
06/20 01:43, 1F
→
06/20 01:43, , 2F
membrane protein在lysis時 try提高Tx-100或做direct lysate
06/20 01:43, 2F
推
06/20 06:48, , 3F
XCell如果你有照他配方正確配buffer 電壓電流時間
06/20 06:48, 3F
→
06/20 06:49, , 4F
都夠 理論上連350kD的都可以過去XDD
06/20 06:49, 4F
推
06/20 09:44, , 5F
140KD感覺並不算很大阿 把時間拉長一點 還有你buffer是?
06/20 09:44, 5F
→
06/20 09:44, , 6F
個人操作的protein常常都是200kD+的 WB還沒什麼大問題
06/20 09:44, 6F
推
06/20 09:50, , 7F
大分子就別試semin-dry了,用wet效率會比較好
06/20 09:50, 7F
推
06/20 16:26, , 8F
我是用濕式 Towbin's Transfer Buffer; 300mA; 3hr
06/20 16:26, 8F
→
06/20 16:27, , 9F
180kDa左右都很清楚
06/20 16:27, 9F
推
06/20 18:52, , 10F
140kD不算大 應該不是轉漬不過去的問題而是其他的問題
06/20 18:52, 10F
→
06/29 20:09, , 11F
fibronectin >230KDa都沒問題了，建議用濕式transfer
06/29 20:09, 11F
‣ 更多 linsnow 的文章
文章代碼(AID): #1C7FVwh- (Biotech)