[求救] 請教有做過sticky-end PCR的前輩

看板Biotech作者 (elmo軒)時間14年前 (2010/05/31 16:56), 編輯推噓6(6推 0噓 12→)
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各位大家好 最近我在準備做sticky-end PCR的前置作業 在網路上找到了一份Protocol 裡面提到在兩管個別做完後 先用PCR Cleaning kit純化 最後在elute的時候使用0.1X TE buffer 再加入PCR時所使用的buffer 再拿去denature and re-nature 我的問題是在用kit純化後他建議使用的elute buffer 是有必須要這樣用嗎? 或是大家有用過其他的方法 可以給我一些建議 謝謝~~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.124.250.117
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用TE是比較好,基本上elute用ddH2O也是做得出來
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推
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TE是保存方面比較好 用水也可以 兩者都用過
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推
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用 Tris 比較好，有 EDTA 的話會影響之後酵素的反應。
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推
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他後續的實驗也就dimer起來 酒精沉澱or用pcr clean
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kit 不管形成dimer時用水或TE後面一樣都可以換掉
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然後就是很high的無CIP處理ligation
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作成dimer那部分用水或TE都可以
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可以把重新配對後的PCR product做PNK處理
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vector依然可以CIP處理 要是你能確定vector切很好
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不CIP處理也沒什麼不好 再來這方法比較麻煩一點在於
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其實重新混合後 理論上大約只有1/4是你要的配對
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不過也就這1/4是有辦法ligation的 只是加反應時自己要
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稍微注意一下量的比例
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兩端都沒有P的ligation產量不更低Orz
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還好耶 我個人操作 vector有無CIP處理都可以做出來
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cloning拿到一個對的就好了 拿一整盤也不會比較有用
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有時候長滿盤我還比較擔心..
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可以考慮先磷酸化 primers 再做 PCR。
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