[求救] 如何去掉plasmid上特定序列?

看板Biotech作者 (無情者傷人命)時間14年前 (2010/05/22 21:10), 編輯推噓5(5推 0噓 10→)
留言15則, 7人參與, 最新討論串1/1
因為小弟對分生實驗不是很熟,想請問板上各位板友, 如果我有一個實驗室前人construct好的plasmid, (amp resist, circular, total~6.5k) 因為實驗設計,我想去掉其中一段約100bp (100bp兩邊無re可切) 不知道有什麼辦法呢? 我目前想到的是PCR, 用primer把要的區域夾出來, 再用blunt end ligation~ 不知道這樣可不可行呢? 還是大家有更好的建議嗎@@ 謝謝回答囉^^! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.202.116
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照你的方法,primer的5'要加磷酸,不然linear接不起來,而且此
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form又會跟原本template在跑膠時幾乎同大小,難以純化
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用site-direct mutagenesis method就好了
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推
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site-direct可以一次去掉100bp!?
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我想到的一樣是用primer夾 兩個primer尾端設計同一個re
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p出來後用re切掉再接起來 再用site-direct去掉
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另外, p出來的是線型, 和環形的template跑膠應該分得吧？
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推
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用樓上do的方法是一般常用的（我們實驗室常在做這類事情）
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用primer加上適當的切位，並利用DpnI將plasmid切除，可以
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避免有太高的背景值
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數百bp跟2~5bp都一樣做法,最長做過1.5k,直接把基因中段砍掉
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我現在大概有些頭緒了~ 多謝你們的回答啦!
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推
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site-direct可以啊
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推
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用PCR sewing的方法就可以啦
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推
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樓上方不方便介紹一下PCR sewing?
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