[求救] ligation的產物降解了？

看板Biotech作者 (豆漿)時間15年前 (2010/05/03 12:03), 編輯推噓4(4推 0噓 9→)
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實驗步驟 將insert(600 bp)及vector(7500 bp)以SapI及XhoI做double-digestion 產物跑gel 有很明顯的band在正確的位置上 double-digetion應該是成功的 將切下來的兩塊gel(分別包含insert及vector 共約500 ul)混合並融化後 加入beta-agarase分解gel (0.5X TBE + 1% low-melting agarose) 直接加入T4 DNA ligase及buffer 16度下反應17小時 以上是按照vector建議的步驟做的 但ligation產物跑膠卻沒任何東西 insert vector 環狀DNA 都沒有 transformation也沒長出東西 猜想大概被降解了 問題會出現在哪個地方呢？ 目前想到 有可能是ligation的環境不對 0.5X TBE 可能不適合反應 不然就是ligase壞掉了 請各位解答 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.44.41
推
05/03 13:16, , 1F
ligation反應體積? transformation體積?
05/03 13:16, 1F
推
05/03 13:23, , 2F
好酷的作法..第一次看到..應該是整個環境不對 太複雜了
05/03 13:23, 2F
推
05/03 14:28, , 3F
第一次看到+1 這樣做能做出來也很神...
05/03 14:28, 3F
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05/03 14:29, , 4F
ligation你的insert和vector要夠乾淨 而且反應體積要小
05/03 14:29, 4F
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05/03 14:31, , 5F
通常我只拿一點去跑膠算比例 剩下的clean up後再做ligation
05/03 14:31, 5F
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05/03 15:37, , 6F
反應體積就是切下來的gel的體積 約500ul
05/03 15:37, 6F
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05/03 15:38, , 7F
我ligation體積只有15ul 原po跑膠看不到是不是根本太稀了
05/03 15:38, 7F
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05/03 15:38, , 8F
我試試clean up之後再ligation看看
05/03 15:38, 8F
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05/03 18:28, , 9F
應該是太稀了啦 算一下你放多少DNA吧
05/03 18:28, 9F
推
05/03 22:57, , 10F
這是說直接把兩片膠溶在一起 之後直接作ligation?
05/03 22:57, 10F
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05/04 01:01, , 11F
反應體積500 那enzyme加多少啊?
05/04 01:01, 11F
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05/04 06:14, , 12F
4ul
05/04 06:14, 12F
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05/08 02:30, , 13F
太稀+1 何不通column? agarose也會影響到ligation
05/08 02:30, 13F
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