Re: [求救] 請教non-reducing western blotting 的 …
關於polyacrylamide electrophoresis的部分
Denaturing electrophoresis: (請把字看清楚喔!!)
Reducing condition - Sample dye 含2-Me或DTT
Buffer 含SDS
Sample 要煮
Non-reducing condition - Sample dye "不含"2-Me或DTT
Buffer 含SDS
Sample "不能"煮
以上兩者都可稱為SDS-PAGE 因為都含SDS
差別只在於reducing reagent的有無
SDS可讓proteins帶負電 但也會破壞non-covalent bond
影響complex及可能影響protein folding
所以non-reducing的proteins也並非在native的狀態 (所以稱denature)
但部分可以保留住protein的structural epitope供Ab辨識
Non-denaturing electrophoresis:
Native condition 也就是所謂的native PAGE
所有dye、buffer都不含2-Me或DTT及SDS
[所以sample dye只含有buffer(控制pH)、glycerol(沈降)跟tracing dye]
Sample不能煮
Buffer system也不太一樣(製膠跟running buffer)
我用過TBE 也看過Tris/Glycine的protocol 不過差異在哪我還不太清楚...
在Native PAGE中 讓proteins電泳只靠proteins自己的電性
可以透過protein PI跟調整buffer pH使之帶負電以進行電泳
但也因為變因太多(PI、pH、size、shape、complex、interaction等)
所以跟marker比對大多會不準...而且bands可能會很醜...XD
PS.如果是棘手的membrane protein想在native下跑電泳
可參考"Blue native PAGE (BN-PAGE)"
以上是我對PAGE的瞭解
至於Western blotting的部分
只要proteins帶負電、可以跑電泳
那一定可以用電轉法將proteins transfer到membrane上 (因為原理跟電泳一樣啊~XD)
SDS-PAGE無論是reducing或non-reducing一定沒問題
而native-PAGE則要控制電壓、時間、調整buffer等
你如果想做native-PAGE的Western blotting
請google一下 http://tinyurl.com/y39thp3
看完後你會發現...
基本上Western blotting的作法是一樣的...XD
PS.我不解的是...你文中的意思應該做了兩次都有出來
但你老闆為什麼只在意有沒有SDS...= =a
※ 引述《sjacky (陳小文)》之銘言：
: 大家好：
: 最近買了一隻抗體 Chemicon, Anti-Apolipoprotein H
: 在Datasheet http://0rz.tw/n6ZTL 上面有寫到non-reducing這個部份
: 問sells的結果他說,在sample buffer的部份不要加入B-me,其他部份都一樣
: 依照他的說法,做了兩次,結果拿給老闆看
: 老闆說 non-reducing的話,連SDS都不能加
: 想要請教一下,有沒有人有作過的
: 想要請教一下作法跟一般western blotting有什麼差別
: 謝謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.205
※ 編輯: Fourfish 來自: 140.116.94.205 (04/10 13:00)
推
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