[求救] pichia pastoris 表現

看板Biotech作者 (火球連發~)時間16年前 (2010/04/02 12:06), 編輯推噓8(8推 0噓 24→)
留言32則, 5人參與, 最新討論串1/1
小弟目前已經把目標基因送到P. pastoris GS115 genomic DNA使用PCR去分析已經能有目標BAND出現 但是使用3ml YPD培養24小時 接踵至15ml BMGY mediem in 50ml離心管OD600=0.15 養24小時OD600=3~4 離心換成15ml BMMY medium 24小時後加150ul methanol誘導 隔天24小時後再加150ul methanol誘導 24小時後取上清液跑SDS-PAGE與測活性 但是活性幾乎都沒有SDS-PAGE也沒有BAND出現 請問是誘導失敗嗎?? 有哪步驟做錯了嗎@@"" 還是要使用有凹底的燒杯去搖? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.35.106
推
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有濃縮嗎??? 想想你的表現量與MEDIUM的量的關係!!
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沒有濃縮耶@@ 要跑column嗎 冏
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不過正常來說 應該上清液就看的到了吧@@
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推
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濃縮1mL medium 跑跑看,搖瓶最好到200 rpm
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我使用250rpm 請問大大1ml怎濃縮@@??
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推
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好熟悉的ID阿...我沒聽過有人用離心管養耶 = =
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04/03 15:40, , 7F
原po是不是看了最近新發表外國人的影片教學阿 @@
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我覺得你的OD600很低 是不是通氣不好 菌長不起來 = =
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上面就是我說的影片 其實我覺得有些地方怪怪的 = =
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菌可以這樣養嗎? 看看就好 =3=
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樓上id也很眼熟XD 我是參考有些paper的protocal
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可能是通氣不好 影片我不能看耶@@ 要登入的樣子
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可能改用搖瓶的試試@@ 希望能有表現冏
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我看完了 他沒用離心管養啦 只是離心XD 他錐形瓶上面蓋
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燒杯 好特別 可以試看看
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看完覺得他們實驗室好有錢@@ 都是高級貨~~
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推
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用final 10% TCA把protein沉澱下來,再用-20冰過的acetone洗
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推
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我建議你用底部有凹槽的flask養 蓋子用塑膠的那種
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我看過有人用矽膠塞 那個通氣也不好 燒杯我不敢試= =
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如果用3 mL試管養24 h OD600應該可以到30幾
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然後接1~1.5%到100 mL BMGY
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我都搖250~300 rpm
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我目前是包鋁箔搖 等明天換塑膠塞看看
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qumai大 沉澱要離心去上清液?acetone洗完用離心嗎?回溶
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是用? TCA有配方嗎@@" 我沒用過 冏
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TCA就是三氯醋酸~比光用丙酮沉澱鹽類少,加入TCA之後4度C
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overnight,離心後再用冰的丙酮洗掉殘留的TCA
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最後用SDS loading dye 回溶就可以了
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04/04 23:25, , 30F
恩謝謝~~要overnight感覺要做好久XD
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推
04/10 03:19, , 31F
-20度1~2小時其實也可以。
04/10 03:19, 31F
推
07/10 04:16, , 32F
除非表現量非常高的菌株才可以直接跑PAGE看到，建議濃縮。
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