[求救] Western & 細胞膜上的蛋白質

看板Biotech作者 (Matt)時間14年前 (2010/04/01 15:53), 編輯推噓6(6推 0噓 6→)
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這問題困擾我很久了,我想請問大家 平常抽Protein的順序為加入RIPA buffer後,12000RPM,及可跑SDS PAGE 但如果要看其他的膜上蛋白,例如NA/K幫浦,離子通道蛋白等.. 是否非得用超高速離心機才可做呢? 小弟研究的主題為Aquaporin 5 (AQP5) in vitro 使用細胞為A253 (唾液腺體),使用普通的total lysis抽蛋白質後 配合Advance ECL,可以壓出AQP5 in vivo SD-RAT活體的組織就撞牆了,壓不出AQP5 我想到的可能性有三點 1.)是lysis buffer使用錯誤? (RIPA、HEPES、UREA??) 2.)唾液腺體成份特別,比起其它的組織,抽取蛋白質的方式不一樣? 3.)膜上的蛋白質,得將膜分離出來後,才壓的出來? (有文獻使用超高速離心,將細胞膜離出後再跑SDS PAGE) 想問有經驗的同行 傳統的total lysis抽不到的膜上特定蛋白. 是否會因為分離出膜後,才能順利壓的到呢? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 210.60.122.14
推
04/01 16:18, , 1F
亂入一下，A549是唾液腺體???
04/01 16:18, 1F
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04/01 16:43, , 2F
A549好像是lung carcinoma cell?
04/01 16:43, 2F
謝謝提醒,A549是我的control,唾液腺體是A253 Orz ※ 編輯: ftsyice 來自: 210.60.122.14 (04/01 16:51)
推
04/01 17:06, , 3F
NKA一般不用離高速就有,除非你的nka量很少..
04/01 17:06, 3F
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04/01 17:07, , 4F
我做過NKA,VHA,NKCC,NHE...都只要離2萬g就可以囉..
04/01 17:07, 4F
推
04/01 20:03, , 5F
原po我居然認識= = 用Kit啦 砸錢下去吧~~~
04/01 20:03, 5F
推
04/02 09:38, , 6F
有沒有嘗試過sonication? 可以幫助萃取膜蛋白
04/02 09:38, 6F
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04/02 09:39, , 7F
我曾經有遇過用ripa抽蛋白壓不出來 但是改用sds抽就壓出
04/02 09:39, 7F
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04/02 09:39, , 8F
來 我覺得您可以參考看看
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04/02 09:40, , 9F
我先聲明我做的和你差很多 不一定適用
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04/02 11:47, , 10F
推樓上 我們家就是用sonication
04/02 11:47, 10F
推
04/03 02:40, , 11F
我們家看膜上蛋白也都是用sonication
04/03 02:40, 11F
推
04/03 17:59, , 12F
可能得加protease inhibitor tissue中有很多protease
04/03 17:59, 12F
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