[求救] Chromatin IP 問題
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
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大家好 我想請教各問高手有關Chromatin IP的問題...
我現在正在做ChIP 我在我的目標蛋白質N端接上一個MYC TAG,只有一個，
而我的蛋白質接上MYC TAG之後的大小為 53 KD，我的目標蛋白質也會跟另外一個蛋白質
interaction，這個蛋白質大小為130 KD，我現在的目標，是要先看看我的菌株(yeast)
在經過formaldehyde之後，anti-myc抗體是否能夠抓到我的目標蛋白質（53KD），
我的步驟如下:
1. 養菌50ml O/N
2. 加入37% formaldehyde 1.4 ml 反應20 min
3. 加入2.5M Glycin 2.5 ml (final con= 125nm)
4. 收菌，以 cold PBS wash 兩次
5. 加入break buffer1.5ml，以及beads，破菌
6. 離心，以1500xg 5min，4 度C 離心，吸取上清液
7. 上清液約1ml，分成兩管，每管0.5ml
8. 做sonication，之後以10000xg 10min，吸取上清液
9. 其中一管，加入anti-myc (monoclon)4度C反應O/N，另外一管當作Input
10. 隔天，有做IP那管加入Protein G beads，反應2 hr
11. 將IP那管以及Input sample去跑WESTERN，看目標蛋白質有沒有被抓到
可是我做完之後，發現我的蛋白質有時候有出現，有時候沒出現，要不然就是訊號很弱，
我用的anti-myc 是 Cell signaling牌子的，使用IP濃度為1:500，總之就是沒有很
理想的結果就是，不知道板上高手有沒有人做ChIP的時候也發生過同樣的問題，抓不到
蛋白質，對了，Input sample部份可以抓的到蛋白質，只有IP的sample抓不到。
我在想可能的原因，會不會是跟我目標蛋白質interaction的蛋白質比較大，所以在
formaldehyde的時候，擋住了我的epitope，希望各位高手能給小弟一些意見，謝謝。
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