[求救] PCR做不出來(已爬文)

看板Biotech作者 (DAN)時間14年前 (2010/02/22 23:54), 編輯推噓12(12推 0噓 13→)
留言25則, 12人參與, 最新討論串1/1
大家好,我想要求救,因為我PCR怎樣都出不來快被老闆追殺了。。。 因為想show一些圖和條件給大家參考,所以有把目前幾次PCR結果貼在網誌上 網誌圖文版:http://hshinyi.pixnet.net/blog/post/24927108 希望大家能給我一點意見。 ---------------------以下全都從網誌來的 只有文字沒有圖------------------------- 我先前有去NCBI做electronic PCR 測試設計的primer專一性 至少目前看起來這對Primer確實可以夾出我要的geneX, 而且專一性高,在genome database裡沒有其他hit。 在genome上的這段序列是high GC content 所以gradient PCR中間的annealing step 我用比較高的溫度 結果失敗。沒有東西。 然後我又另外加了betaine(5M) 1 uL DMSO濃度不變 只有1％ Gradient PCR範圍拉大 從55～67度 結果只有前面大約55～58左右有PCR產物出現 可是卻沒有我要的PCR產物 (大小約463bp) 後來我突然想到來PTT找看看有沒有人有這問題 搜尋文章後發現先前有人建議 若GC比例高(60~70%) DMSO濃度可以升高到7.5～10％ 然後我就試了這個條件 結果還是失敗 整塊膠超乾淨的 只看到marker跑的超漂亮...=___=" （救命啊～） ---------------------------------------------------------------------------- * 最亮那條marker是500bp * PCR program: 1. 95'c, 10min 2. 95'c, 45sec 55~67'c, 1min 72'c, 30sec (29cycles) 3. 72'c, 10min 4. 4'c, 10min *Taq和dNTP還有Genomic DNA理論上都沒有壞 因為跑其他組Primer都沒有問題。 ---------------------------------------------------------------------------- 如果有人可以給我建議 請問我現在應該更改什麼條件會比較好？ 改DMSO濃度？ 改Betaine濃度？ 改PCR條件？ 拜託各位幫忙了～ 謝謝。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.118.180
推
02/23 11:26, , 1F
cycle=29 不覺得太短嗎? 不如cycle內時間短些,cycle數長些
02/23 11:26, 1F
推
02/23 11:51, , 2F
DNA 1ul的濃度是多少?
02/23 11:51, 2F
→
02/23 11:52, , 3F
genomic DNA濃度約50ng/uL
02/23 11:52, 3F
推
02/23 12:25, , 4F
用什麼酵素？
02/23 12:25, 4F
推
02/23 12:33, , 5F
第一個step為什麼要設到95度10分鐘?很長耶這個時間
02/23 12:33, 5F
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02/23 12:35, , 6F
應該94度5分鐘就夠了吧...denature我只設94~貌似有聽過太高
02/23 12:35, 6F
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02/23 12:35, , 7F
溫會加速Taq半衰期之類的....
02/23 12:35, 7F
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02/23 12:39, , 8F
酵素是Fermentas的Dream Taq
02/23 12:39, 8F
推
02/23 13:56, , 9F
總體積作20μL 第一個step 94度 5分鐘 試試看
02/23 13:56, 9F
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02/23 13:56, , 10F
DMSO 5%
02/23 13:56, 10F
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02/23 21:55, , 11F
樓上,那要加betaine嗎?
02/23 21:55, 11F
推
02/23 23:56, , 12F
以你的長度95度不需要那麼久 dntp看起來有點少
02/23 23:56, 12F
推
02/23 23:58, , 13F
annealing的溫度可以從50度開始試 先有主band再說
02/23 23:58, 13F
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02/24 00:00, , 14F
有主band出現 再來調鎂離子濃度(一開始的鎂要用最低去試)
02/24 00:00, 14F
推
02/24 03:44, , 15F
建議換專為高GC狀況使用的酵素，和其他實驗室借或索取樣品
02/24 03:44, 15F
推
02/24 09:43, , 16F
finnzyme的phusion DNA pol有GC-rich專用的buffer 可試試
02/24 09:43, 16F
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02/24 11:09, , 17F
我使用的Buffer裡面已經有含Mg 不需要外加耶...
02/24 11:09, 17F
推
02/24 17:05, , 18F
betain可以試著再增加到反應濃度為1-1.5M間。
02/24 17:05, 18F
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02/24 17:06, , 19F
betaine
02/24 17:06, 19F
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02/24 20:22, , 20F
可以同時試看看其他酵素 KAPA ROBUST
02/24 20:22, 20F
推
02/24 21:27, , 21F
我會試兩三種不同家的酵素 annealing溫度降低到50
02/24 21:27, 21F
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02/24 21:28, , 22F
出不來的話直接重新設計一對primer 不要與上一對的座落位置
02/24 21:28, 22F
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02/24 21:29, , 23F
有重疊到 然後再跑PCR... 加油～
02/24 21:29, 23F
推
02/26 10:46, , 24F
好像我同學做的耶...是昆X嗎..呵
02/26 10:46, 24F
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03/02 01:30, , 25F
樓上 我想我不是你同學耶...
03/02 01:30, 25F
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