[方法] 皮膚冷凍切片

看板Biotech作者 (fay)時間14年前 (2010/01/13 16:59), 編輯推噓4(4推 0噓 12→)
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因為實驗室的學長姐之前只做過骨頭的冷凍切片,而且只H&E染色 其他組織是做石蠟切片(做IHC) 但是我是要做小鼠皮膚組織的冷凍切片,要做IHC跟IF 目前我看實驗室的protocol有幾個地方覺得怪怪的 1.冷凍切片組織完全沒有固定這個步驟 切完片就-20度C保存,染色前PBS wash 2. IHC跟IF的 blocking 用 奶粉泡 ====================================================== 我參考santa cruz 跟 IHC world 的protocol santa cruz建議: 切片後染色前用冰的acetone 固定10 mins, blocking用 10% normal serum/PBS IHC world建議: 切完片的瞬間,馬上把slide放到95% EtOH固定 我要染的那幾個蛋白(PCNA,mmp-1)不需要blocking ======================================================= 另外,目前試做發現用PBS wash,組織很多都漂起來,問其他做骨切片的也是這樣 造成好幾片切片都不能用,有沒有什麼好方法? 可以請有經驗的人給我一點意見嗎? 非常困擾 謝謝大家~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.128.64.100
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01/13 17:30, , 1F
你有用coating 片嗎?
01/13 17:30, 1F
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01/13 20:19, , 2F
我切完會放在bench上風乾o/n，隔天可以直接染或放-80保存
01/13 20:19, 2F
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01/13 20:20, , 3F
染色前用4% PFA或acetone固定，blocking用10%二抗的血清
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01/13 22:32, , 4F
切片厚度不要太厚!你的是切多少?
01/13 22:32, 4F
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01/14 21:17, , 5F
我是使用coating片沒錯,厚度是5~8um
01/14 21:17, 5F
推
01/14 22:40, , 6F
在貼片時~盡可能不要折到切下來的OCT~一有空隙很容易
01/14 22:40, 6F
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01/14 22:40, , 7F
漂走~不然就是在wash時不要整個下去洗~用tip抽吸抽吸~
01/14 22:40, 7F
推
01/15 01:18, , 8F
我也是小鼠皮膚，切5micron，但從來沒掉過阿，原PO要不要
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01/15 01:19, , 9F
換其他廠牌的玻片看看阿，wash要用tip抽吸實在很麻煩@@
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01/15 01:28, , 10F
k大,請問你是用哪一家的玻片阿?
01/15 01:28, 10F
推
01/15 13:26, , 11F
Thermo的。另外可能包埋的過程也沒做好吧，你包埋前有用
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30% sucrose脫水嗎？然後切完片一定要風乾
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01/17 19:51, , 13F
感謝k大,看來我是因為沒有風乾,現在好多了
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推
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我也是切小鼠皮膚,有時sample太小做IHC很容易脫落
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01/19 17:03, , 15F
如果沒辦法改善的話,可以考慮自己coating喔
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01/19 17:04, , 16F
可以調整lysine的濃度,片子品質會比常傷賣得好喔
01/19 17:04, 16F
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