[求救] 請問該用TCA或acetone沉澱蛋白?

看板Biotech作者dawzfeminis (S)時間14年前 (2009/12/31 11:42)推噓1(1推 0噓 13→)

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各位前輩最近操作蛋白沉澱發生了一些問題，想求助各位前輩我分別用過TCA沉澱與acetone沉澱，雖然兩者皆可以壓到wild type protein, 但在其他WB中預期會看見的bend卻沒看見，更奇怪的是，TCA沉澱看到的bend 在acetone沉澱結果中卻不見了，因此想請問各位前輩的看法如果作法上有什麼瑕疵的，也請前輩們指正，謝謝! 我的蛋白構築在invitrogen的pSecTag2 vector中 transfect至cos-7細胞表現後，蛋白會被分泌到medium中我先嘗試以TCA方法沉澱， medium加入final 20% TCA後，放置冰上10分鐘以沉澱蛋白，14k rpm, 5 min離心將pellet以acetone wash 兩次後，以95度烘乾，加入pierce的 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 回溶pellet，因無法完全溶解因此離心後取上清液定量後進行WB 後因TCA沉澱之pellet太難回溶，想改以acetone沉澱參考的步驟是來自pierce的protocol http://www.piercenet.com/files/TR0049-Acetone-precipitation.pdf medium加入final 80% 冰的acetone後，置於-30度5小時，以14k rpm, 10 min離心將pellet wash後，以50度烘乾，加入pierce的 M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 回溶pellet，雖然以acetone沉澱得到許多pellet，但是卻無法完全溶解，因此同樣是離心後取上清液定量後進行WB 有想到幾點想請問，關於acetone沉澱中acetone final 80%，是否有需要改低一點? 還有就是TCA沉澱與acetone沉澱得到的蛋白質或是得到的pellet內含物是否會有所不同? 例如非蛋白質的雜質較多...等如果還有其他思慮不週的部份，還請各位前輩指出，謝謝! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.72.94

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