[求救] digestion的問題

看板Biotech作者 (FENOR)時間14年前 (2009/12/21 14:19), 編輯推噓4(4推 0噓 12→)
留言16則, 5人參與, 5年前最新討論串1/1
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 小弟我做的是將一條920bp的片段接到PET32a(5900bp)裡面， 切位是EcoRI Xho1， 但是做digestion check的時候，卻發現出來的兩條band， 都很明顯的比insert和vector要大很多，甚至還比那兩個加起來都還要大@@ 求救，這情況已經發生過好幾次了，上次好不容易做出來，沒想到這次又再發生了> < 有沒有知道這是怎麼一回事啊? 我在ligation之前有跑過膠，確定insert和vector是我要的東西， 但是在做完transform挑菌後，整個都不對。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.125.84
推
12/21 14:51, , 1F
我猜是vector互黏，vector確實做好CIP的處理，或拉高
12/21 14:51, 1F
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12/21 14:51, , 2F
insert的比例
12/21 14:51, 2F
推
12/21 14:53, , 3F
兩個ori的plasmid會複製?
12/21 14:53, 3F
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12/21 14:54, , 4F
我覺得要先確認comptent cell有沒有被汙染吧
12/21 14:54, 4F
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12/21 14:58, , 5F
和學長姐用的是同一批competent cells 但學長姐們沒有問題
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12/21 14:59, , 6F
我insert和vector的比例，體積比5:1 但總量的比沒定量= =
12/21 14:59, 6F
推
12/21 16:39, , 7F
如果一開始你拿等量的DNA，elute相同體積，照你的作法
12/21 16:39, 7F
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12/21 16:40, , 8F
這樣充其量V:I不過1:1而已y
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12/21 16:57, , 9F
SORRY,上面算錯
12/21 16:57, 9F
推
12/21 17:38, , 10F
原po你的colony都挑完了嗎要不要再多挑幾個切切看
12/21 17:38, 10F
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12/21 17:40, , 11F
我之前做TA cloning時也有遇到類似的狀況 不過多挑幾
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12/21 17:42, , 12F
還是有切出我預期的size
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12/21 18:46, , 13F
我再多挑幾個試試看好了......這次加uncut control試試看
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12/21 20:37, , 14F
一個plasmid確實不能有相同的兩個origin
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11/11 01:54, , 15F
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01/03 17:04, 5年前 , 16F
SORRY,上面算錯 https://noxiv.com
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